免费下载《如何在多色共聚焦显微镜中突破光谱局限进行多重标记》
多色共聚焦显微镜经常受到样本中荧光探针光谱重叠的限制。本文探讨了荧光团光谱分离中的常见挑战以及如何克服这些挑战，包括使用荧光寿命成像作为分离具有重叠光谱的荧光团的替代方法。
介绍
多色共聚焦显微镜是当今细胞生物学实验室中的一种基本技术。为了揭示生物系统的复杂性，需要能够同时分析样本中的多个结构、分子和微环境，并将它们相互关联。这可以通过使用不同颜色的荧光标记或生物传感器标记每个感兴趣的特征来实现，然后进行同时或顺序的多通道成像，以捕获每个探针在特定通道中的信号。然而，这种“多重化”方法的荧光染料数量是有限的。本文将深入探讨限制多色共聚焦显微镜多重化能力的一些挑战，以及改善荧光染料分离并增加可区分荧光探针数量的一些策略。
为什么多色共聚焦实验如此具有挑战性?
在多色共聚焦显微镜中，无法找到合适的荧光探针组合是一个常见的难题，这可能会显著延缓实验进展。导致这个问题的因素包括可用于光谱分离的荧光染料或荧光蛋白(FP)的可用性，以及共聚焦系统的限制，例如激发线、滤光片和探测器的数量和特异性。虽然有机荧光体的激发和发射峰通常在其最大高度的一半(FWHM)处宽度约为35纳米，但完整的光谱特征往往可以跨越几百纳米，包括肩部和长尾部(见图1)。考虑到可见光谱本身仅跨越约360纳米(从约380到740纳米)，在多色实验中，特别是结合超过三种荧光体的实验中，光谱重叠几乎是不可避免的。光谱重叠可能导致严重的伪影，包括荧光团之间的不必要能量转移和一种荧光团的发射信号渗透到另一个荧光团的检测通道中(也称为光谱串扰或交叉)。此外，还可能遇到自发荧光和光毒性问题，这些问题使得在某些光谱区域激发染料变得不可行。
考虑一个四色实验，其中首选染料为Alexa488、Alexa546、Alexa568和TOT0-3(图1)。激发线必须仔细定位，以避免在每个通道中激发超过预期的染料。这可能会带来一些权衡，例如由于偏离峰值中心而导致某些物种的激发效率低下。更重要的是，发射曲线的强光谱重叠使得避免串扰伪影成为一项挑战。因此，很难判断在受影响的图像通道中，实际上是哪个荧光染料产生了你所看到的信
本次课程聚焦于共聚焦技术的三个关键学习领域：
1、共聚焦基础和成像原理
深入了解共聚焦技术的基础知识和成像原理，揭开科技背后的神秘面纱。
2、 共聚焦成像的常见问题以及优化方案
探讨在共聚焦成像过程中可能遇到的常见问题，并分享解决方案，助你优化实验和应用。
3、 共聚焦显微镜的几项小众应用
发现共聚焦显微镜的一些令人惊叹的小众应用，拓宽你对这一技术的认知边界。
依托基于人工智能分析软件的稀有事件检测技术，发挥自主共聚焦显微镜的功能。
徕卡显微系统宣布推出由Aivia 提供支持的自主显微镜，让科学家能够从实验中自动提取最为相关的数据，从而获得更多科学发现。
徕卡显微系统携手仪器信息网于2023年10月26日组织召开《AI引领自动化显微时代》网络会议，徕卡显微系统高级应用专员殷艺璇在大会期间分享报告《AI引领自动化显微时代——leica 自主共聚焦显微系统介绍》。
荧光寿命是荧光团在发射荧光光子返回基态之前保持其激发态的平均时间长度。这取决于荧光团的分子组成及其微环境。
FLIM将寿命测量与成像相结合：对每个图像像素以测得的荧光寿命进行颜色编码，产生额外的图像反差。因此，FLIM可以提供关于荧光分子空间分布的信息和有关其生化状态或微环境的信息。FLIM的典型应用是FLIM-FRET。FRET是研究分子相互作用的成熟技术。它能用来研究蛋白质结合并在埃的尺度上估算分子间的距离。
Confocal re-imagined 重新定义共聚焦
在显微成像领域，我们的使命是助您持续推动科学进步。现推出重新定义的共聚焦显微系统，助您臻于真像。
1.观察更多的洞察力、更亮更多细节、信号检测超灵敏、增强多色灵活性、活细胞温和成像
2.探索更多的高潜力、探索崭新信息维度、提高成像质量、超越光谱的多维度
3.产出更多的生产力、复杂实验亦可简单操作、穿梭时空尺度、重大细节转瞬鉴别
发育生物学是一门研究生物体从精子、卵子发生, 形成受精卵, 然后生长发育直至衰老、死亡的过程及机理的一门学科。虽然共聚焦显微镜具有非常高的分辨率, 可以提供分析所需的空间信息, 但由于传统共聚焦显微镜单点扫描的特性, 采集速度太低，无法满足发育生物学对成像速度的要求。
人工智能的出现改变这了一切 - 使用人工智能增加图像信噪比及进行图像分割, 可以提高分析效率及数据准确性。本期网络课堂将介绍崭新的共聚焦成像和AI图像分析技术如何应用在发育生物学。
