徕卡征文大赛好文分享|从容应对SP8共聚焦显微镜的日常小问题
以下内容来自徕卡征文大赛投稿文章，作者许佳玲，来自中山大学生命科学学院实验中心，拍摄所用徕卡显微镜型号为徕卡SP8共聚焦显微镜
本文2000多字，总结了大量客户使用徕卡SP8共聚焦显微镜的心得体会，颇为难得。作为徕卡上一代共聚焦显微镜，SP8系列上市已近十年，被全球科研工作者广泛应用，在中国也有庞大的用户群。徕卡欢迎广大客户与我们分享使用心得，帮助我们不断满足新的客户需求。
早几年徕卡SP8机型共聚焦显微镜在国内显微镜市场叱咤风云，而我们单位有幸购置了两套SP8机型的共聚焦显微镜。我们在使用中遇到的各种小问题，好在有应用和售后工程师为我们的实验开展保驾护航。借此机会和大家分享徕卡SP8共聚焦显微镜新手用户常见的小问题。
1、承载器皿有要求
承载器皿是很多新手遇到的第一个问题，常有小伙伴带着塑料小皿就开开心心来上机，测试过程发现高倍镜聚焦不到清晰图像。
为此我们在仪器的预约页面特别强调了样品承载器皿的折光率要均匀、厚度一般不超过0.17毫米等要求，也提供相应耗材给用户付费领取。
2、开机时的参数怎么选，一不小心拍出来的图有点渣？
某天小伙伴开机后发现成像速度飞快，出图异常粗糙，成像速度只有8000这一个选项。
他的问题出在开机时不小心选择了振荡扫描（下图白色箭头所示）。振荡扫描是SP8的高速扫描模式适合快速捕获图片的动态变化，同时牺牲部分成像质量。
图1 软件开启界面
若我们的样品没有快速的动态过程，则在开机时看到以上图片界面时记住小口诀：“两个确认，两个off”（确认设置和显微镜型号、震荡扫描和加载设置为off）。
3、荧光串色怎么破？
做过共聚焦成像的小伙伴常会听到串色一词，何为串色？一般串色是指样品发射的荧光互相干扰，可理解为多色荧光成像时，不同荧光互相干扰导致最后荧光出现的区域不准确，最常见的串色如：DAPI、自发荧光等，针对这类串色样品我们可设置序列扫描来解决。
图2 多色荧光光谱交叉示意图
4、设置line序列扫描时需要注意什么
Line序列扫描的优点是在预览过程中同时出几个荧光图像。我们也遇到过资深博士生过来做实验，看他迅速地在软件里挨个添加序列设置，点击live，只见共聚焦慢悠悠地预览出图片。他就犯难了，为什么line模式会比往常的frame模式还慢？
原因在于这个博士生通过逐个手动设置序列扫描光路，忽略了光路中自动匹配滤镜等光学硬件的切换，当不同设置相互切换时，仪器需要时间去做硬件调整，于是慢悠悠地出图。
图3 软件自动匹配内部滤光硬件界面
我们该如何正确进行line序列扫描成像设置呢？如下图所示：先设置一个多通道成像模板（同时满足所有荧光的激发和检测）；再打开序列扫描复制出多个序列；到每个序列内通过调整激光的百分比和检测器的开关完成各自序列的设置。这样当我们再次预览时，仪器则不需花费时间用于光学滤镜等硬件的切换。
图4 序列扫描设置示意图
此外，软件里还有个便捷的设置方法：用智能设置，只需选择荧光名称和伪彩，选取拍摄模式就行。
5、如何得到更精致的图片？
新手拍的图片，导师们常会觉得太粗糙，我们能从哪里改善成像效果？
Acquisition mode菜单是调整成像质量的地方，例如可以完成提高成像画幅格式、降低速度、缩减成像区域、调整角度、利用平均降噪或叠加等功能让图像更加准确美观。
6、一见报错就慌神， safety interlock是什么意思？
图5 软件报错界面
这项报错提醒我们显微镜的镜臂未放好，激光属于高功率光源，特别是紫外、双光子等具有较大杀伤性，厂家在设计仪器时考虑到危险系数，我们通过目镜观察样品时用的光源为金属卤化物灯，而当用激光作为光源成像时则只能由检测器来检测荧光。常见于更换样品后，当镜臂未放置到正确位置，则会触发安全装置，出现报错。这时我们会看到样品上没有激光光斑，为了安全起见激光被内部安全闸门关住，无法到达物镜。这个安全装置很贴心，市面上大部分共聚焦显微镜都配置了该功能。
7、不想换物镜加镜头介质，穷尽一切用zoom in
小伙伴们听说共聚焦能用zoom in做光学放大，用低倍镜预览样品后懒得更换物镜，直接zoom in >10，觉得这放大倍数也够。
这是大家常忽略物镜的数值孔径导致的，数值孔径表示物镜能够分辨精细结构的能力，数值越高分辨能力越强，例如，同一个样品用10倍物镜zoom in=10成像，和用100倍物镜zoom =1 做对比， 10倍zoom in虽然检测器可以做光学放大，但是前端的物镜无法分辨细节，无法让我们看清细节，我们常称之为空放大，所以当我们需要对细节进行成像时绝对不能偷懒用低倍镜。
8、Live按钮变灰色怎么办？一招重启包治百病（硬件故障例外）
由于共聚焦显微镜的功能全面，所需硬件较多，在使用中难免会出现各种小问题导致软件识别不到硬件报错。遇到此类问题我们会先查看报错归属的是那部分硬件，退出成像软件，重启相关硬件开关。当无法确定哪部分硬件出错，则整机重启。整机重启后仍无法解决问题，我们就联系徕卡售后寻求协助。
9、怎么用好白激光？
白激光与常规连续型单一波长的激光器相比有以下几个好处：A.白激光是皮秒级别的脉冲激光，能通过调整其频率得到不同的激发间隔，利用这个间隔我们就可以结合HyD检测器利用gating门控过滤掉杂散信号或自发荧光干扰；B.虽然白激光的单谱线激发光功率不如连续型激光器，但胜在白激光最多同时可出8个不同波长的激光协同激发；白激光在470-670nm之间能灵活进行1nm步进的调节，它能让我们的共聚焦显微镜适应目前层出不穷的荧光标记物。
图6 HyD门控功能界面
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