阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD），俗称“老年痴呆症”，是一种严重的神经退行性疾病，患者通常会出现以记忆力衰退、学习能力减弱为主的症状，并伴有情绪调节障碍以及运动能力丧失，极大地影响个人、家庭乃至社会的发展。目前，全球约有5000万人罹患AD。随着人类平均寿命增长、老龄化社会加剧，AD患病率也将不断上升，预计到2050年AD患者将增加至1.5亿以上。已有研究表明AD发病与代谢性改变相关，且AD具有很强的遗传性。目前仍缺乏预防或治疗AD的有效方法。组织及细胞相关的各类光学成像技术的应用有助于AD病理学特征检查、揭示病因机制，从而探索开发新的治疗策略。

以下将与大家分享徕卡Cell DIVE和LMD产品在研究AD蛋白质组学中的应用。

阿尔茨海默症(AD)机制研究中的组织及细胞光学成像：徕卡Cell DIVE和LMD产品在研究AD蛋白质组学中的应用

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD），俗称“老年痴呆症”，是一种严重的神经退行性疾病，患者通常会出现以记忆力衰退、学习能力减弱为主的症状，并伴有情绪调节障碍以及运动能力丧失，极大地影响个人、家庭乃至社会的发展。目前，全球约有5000万人罹患AD。随着人类平均寿命增长、老龄化社会加剧，AD患病率也将不断上升，预计到2050年AD患者将增加至1.5亿以上。已有研究表明AD发病与代谢性改变相关，且AD具有很强的遗传性。目前仍缺乏预防或治疗AD的有效方法。组织及细胞相关的各类光学成像技术的应用有助于AD病理学特征检查、揭示病因机制，从而探索开发新的治疗策略。

以下将与大家分享徕卡Cell DIVE和LMD产品在研究AD蛋白质组学中的应用。

应用Leica Cell DIVE多重成像进行AD疾病脑空间蛋白质组学分析

Cell DIVE多重成像结合Cell signaling Technology的IF/IHC 验证抗体，围绕AD的病理标志，检查突触及细胞的空间位置，并分割和聚类分析识别空间共定位的细胞群，例如疾病相关的小胶质细胞标志物定义的细胞亚群。通过细胞类型特异性标记结合多重组织成像，进一步了解人类大脑的空间异质性。

实验方法：

• CST抗体经过严格的验证过程，以确保在FFPE组织上的性能。本研究中所有抗体均为直接偶联抗体。（表格1）

• 组织从商业来源获得 (BioChain，表格1) 。

• 成像：在Cell DIVE成像仪上使用四个通道加DAPI对载片进行成像，自动对焦，自动校正和拼接。图像采集在2周内进行。

• 图像分析：使用AIVIA 13导入、融合和分析拼接图像。应用AI驱动的模块，对蛋白表达进行量化、表型分析。

图4.1 A .成人对照和B. 成人阿尔茨海默病脑切片的多重成像，显示了15个生物标记物。C. 上: 神经元标记物的空间定位 ，以了解AD大脑外周与内部表达的异质性；下图：通过像素分类器来分割AD脑中的所有表型标记。D.以星形胶质细胞(GFAP、S100B)、小胶质细胞(TMEM119、IBA1)、成熟神经元(Enolase2)和阿尔茨海默病相关标志物(TauGT-38、p-Tau217、P-Tau181和β-淀粉样蛋白)特异性标志物表达为特征的细胞表型。DAPI显示为蓝色。E. β-淀粉样斑块横截面积(大小)直方图。F.量化面积比，以估计阿尔茨海默症大脑中标记物表达与对照组相比的百分比变化。

图4.2了解阿尔茨海默病大脑的神经元空间布局。A . AD大脑中所有神经元成分的相关图，热图中显示了所有测量值对之间的Pearson相关系数。B.与阿尔茨海默症斑块相关的空间图像。箭头表示β -淀粉样蛋白阳性斑块段，20 um宽径向圆显示斑块周围聚集的邻近细胞类型，标记为GFAP+， S100B+， TMEM119+和IBA1+细胞。C.基于β -淀粉样蛋白斑块大小的AD大脑周围的聚类揭示在较大斑块周围的几个细胞群的富集以及基于与β -淀粉样斑块的相对距离，已确定的表型聚类。左下：基于与斑块相对距离编码的GFAP+细胞分割的代表性图像。

图4.3杏仁核中AD相关标志物。AD杏仁核中神经原纤维缠结(洋红色)、斑块中β淀粉样肽Aβ沉积(白色)和GFAP+(绿色)星形胶质细胞的定位。人AD大脑杏仁核内侧核相对没有神经原纤维缠结和β斑块。在杏仁核的其他区域，如AD大脑的副基底区，缠结和β斑块明显上调。

应用徕卡激光显微切割LMD研究AD和轻度认知障碍MCI患者脑淀粉样血管病蛋白质组的差异

脑淀粉样血管病(CAA)以Aβ沉积在脑血管系统为特征。AD则和老龄化、脑出血有关，并导致认知障碍。为了更好地了解分子机制，我们从年龄匹配的对照组(n=10)、轻度认知障碍(MCI，n=4)，散发性AD (n=6)，利用LMD特异地分离病理组织，然后进行无标记定量质谱分析。

样本及免疫组化(IHC)：

FFPE 8um切片，放在PET膜玻片上，二甲苯和乙醇洗涤再水化，0.3% H2O2中孵育20分钟，在10%山羊血清中封闭1小时，用4G8一抗(1:1000,biolgend #800711)在4℃下孵育一夜，洗涤后在生物素化小鼠二抗(1:1000,Vector实验室)中孵育1小时，然后用亲和生物素过氧化物酶(Vector实验室)孵育1小时。切片用DAB溶液(ThermoFisher)孵育10分钟，随后用苏木精(Sigma #MHS16)反染，并在封闭容器中风干过夜。

LMD切割：

从n=10例对照 CAA(-)、n=4例MCI [CAA(+)和CAA(-)]和n=6例AD [CAA(+)和CAA(-)]病例中，以每例2 mm2的一致面积将灰质中有管腔和血管壁的血管显微切割到质谱级水中(Thermo Scientifc)。包括大血管和毛细血管，不含轻脑膜和白质中的血管。14000 g离心2 min，80℃保存。以上使用Leica LMD6500 10倍物镜完成样品切割。

图5.切割CAA(+) (Aβ阳性)血管和CAA(-) (Aβ阴性)血

深入理解大脑疾病的空间异质性，可通过多重免疫荧光组织成像的方式获取更多空间蛋白的相关信息，Cell DIVE专利的循环染色方法和经验证的370+抗体库将会是您研究的得力工具。

LMD作为组学研究中枢，可以和其他空间成像技术相辅相成，并结合AI识别，提供从组织到单细胞水平样本的分离收集，为下游发现新的biomarker、药物靶标开发，疾病分型诊断、精准医学提供新观点。