光片显微镜中的光束选择

光片显微镜（Light-Sheet Microscopy, LSM）是一种强大的三维成像技术，广泛应用于生物学研究。本文将为您科普光片显微镜中的不同光片技术，重点介绍主瓣、光切片、长度、分辨率、对比度和激光强度等关键性能指标及其相互关系。

光片显微镜简介

光片显微镜通过在样品上形成一层薄而均匀的光片来照明，从而获得样品的二维图像。通过移动样品或光片，可以快速获取整个三维样本的图像。这种方法不仅减少了光漂白和光毒性，还提高了成像速度和深度。

主瓣与光切片：光片的“心脏”与“躯体

在光片显微镜中，主瓣是指光片中强度最高的区域，它直接影响着显微镜的轴向分辨率。主瓣越薄，理论上分辨率越高。然而，光片的光切片，即整个光片的厚度，同样对成像质量有着决定性的影响。光切片不仅包括主瓣，还包括可能影响对比度的旁瓣或次要结构。

在许多先前的出版物中，未能区分光片厚度和主瓣厚度可能会导致混淆，例如在提到“通过扫描贝塞尔光束产生的超薄平面照明”或“超薄贝塞尔光片”时，主瓣比相同长度的传统高斯光片更薄【19,25】。对于最常用的具有高斯分布的光片来说，只有一个光片，主瓣厚度和光片厚度的测量值严格成比例。但如图1 所示，这对于具有辅助结构（如侧瓣或多条平行光片）的多瓣光束并不适用。

对于多瓣光束，当仅考虑主瓣厚度时，样品暴露的总照明功率中有相当一部分被忽略。这种额外的曝光会在光片显微镜中贡献到检测到的荧光信号，从而可能降低图像对比度。因此，考虑以下几点非常重要：通常显示的沿检测轴的 PSF 切片可以用来推断轴向分辨率。然而，它们使观察者无法计光学分层性能或光片厚度。

图 1. 不同光束形状对光片显微镜中轴向分辨率 dz 和光学切片 OS 影响的示意图。

照明点扩散函数（PSF，蓝色）表示照明光的强度。

检测点扩散函数（PSF，绿色）表示荧光光子的位置依赖性检测概率。

虚线表示等强度表面，例如，峰值的 37%。

虚红线表示结合照明和检测 PSF 的等表面（照明强度和检测概率的乘积）。它沿检测轴的范围与系统的轴向分辨率成比例。

绿色阴影区域表示荧光分子被照明并收集荧光的体积。光学切片测量该体积沿检测轴的范围。

在 a) 中，显示了单瓣照明光束，分辨率是各向异性的，即横向分辨率优于轴向分辨率，但光学切片接近轴向分辨率。

在 b) 中，显示了多瓣照明光束，分辨率是各向同性的，但从旁瓣照明区域收集到额外的荧光信号。光学切片劣于轴向分辨率。旁瓣照亮离焦平面，使图像模糊。 

光片长度：决定视野的关键

光片的长度是另一个关键参数，它决定了可以均匀照明的样本区域大小。较长的光片可以覆盖更大的视野，但可能会牺牲一些分辨率。

分辨率与对比度：成像质量的双重奏

分辨率是衡量显微镜性能的基石，它决定了我们能看到的最小细节。而对比度则是图像中亮区与暗区的差异，高对比度意味着更清晰的图像细节。在光片显微镜中，主瓣的厚度和光切片的均匀性共同决定了分辨率和对比度：

• 轴向分辨率取决于显微镜点扩散函数（PSF）沿检测轴的分布宽度

• 图像对比度取决于光片的整体厚度

激光强度：照亮微观世界的光源

激光强度是生成光片的基础。不同强度的激光可以产生不同特性的光片。例如，高强度激光可以生成更薄的主瓣，但也可能增加样品的光漂白和光毒性。

图 2. 主峰厚度和光学分层的定义。展示了单峰光束 (a) 和多峰光束 (b) 的强度在 yz 方向上的横截面。在焦点处 (紫色线) 和距离 y = L 处 (厚度加倍的地方, 蓝色线) 的相应剖面显示在 c-j 中。c, d 和 e, f 分别说明了单峰光束 (c, d) 和多峰光束 (e, f) 的主峰厚度，定义为在焦点处强度高于最大强度 37% 的范围，分别在焦点处 (c, e) 和距离 y = L 处 (d, f)。子图 g-j 相应地说明了光学切片厚度 wOS ，定义为包含光束功率 63% 的范围。

观察由扫描光束形成的光片时，相关的测量包括：

• 在检测轴上强度首次下降到峰值强度的一部分的距离

• 在距离检测焦平面一定距离内由光片产生的总荧光量

第一个测量标准提供轴向分辨率，而第二个提供对比度。轴向分辨率是沿检测 z 轴可以分辨出两个物体的最小距离。对比度是聚焦特征信号与背景信号（主要来自失焦特征）的差异。图 2a 显示了由单峰光束形成的光片的示例。图 2c 和 2d 显示了在光束传播轴上两个位置处以 1/e=37% 峰值强度测量的分布宽度，图 2g 和 2h 显示了标记光束总能量 63% 的积分轮廓。在强度大于峰值强度 37% 的范围内，高斯强度分布的光片携带其总能量的 84%。原因在于光片不是一个圆对称光束，而是主要沿检测轴向一个方向扩展。

在比较不同光片时，第一个测量标准（强度下降）与第二个测量标准（区域内包含的能量）之间的比例与任何长度的单峰光片的比例数值无关。

对于多峰光片来说，第一个和第二个测量标准得到的值可能会有显著差异，因为它们表现出更复杂的结构。如图 2 右侧所示，强度分布降到峰值的 1/e 的距离仅反映了主峰的厚度（图 2e, f）。因此，作者引入了“主峰厚度”这个术语来表示这个测量标准。图 2i, j 中标示的光学分层 wOS 考虑到主峰可能不具备足够的能量来贡献总检测信号的 63%。

这一测量标准给出的值明显大于主峰厚度，更接近反映了光片的真实厚度。

性能间的关系：协同与权衡

在实际应用中，这些性能参数之间存在着协同与权衡。例如，追求更薄的主瓣以提高分辨率可能需要牺牲一些光切片的均匀性，从而影响对比度。同样，增加激光强度以改善信噪比，也可能带来光漂白的风险。

不同光片技术的原理与应用

1. 高斯光片

最常见的光片类型，以其简单的高斯强度分布而著称。适用于需要均匀照明的大视场成像。

2. 聚焦平坦顶光片

在焦点处提供均匀的照明，但边缘有较弱的环状结构，适用于需要高对比度的成像。

3. 贝塞尔光片

具有自我重建的特性，即使在复杂介质中也能保持形状不变，适用于需要高分辨率的成像。

4. 艾里光片

通过特定的相位调制产生，具有在特定方向上传播的特性，适用于需要高对比度和高分辨率的成像。

5. 双光束光片

通过两个子光束的干涉产生，形成一系列光片，适用于深层样品成像。

图2. 各种光束类型相对于高斯光束的光学分层（蓝色）和主瓣厚度（橙色）的比率。所有值均为光束长度 L 约为 30 µm 计算得出。插图显示了解释图表的方案。值大于 100% 表示主瓣或光学分层比高斯光束更厚。

对于所有类型的光片显微镜，光学切片和轴向分辨率取决于光片的长度。因此，仅在长度相等的情况下比较光片特性是至关重要的。在大多数情况下，长度是由样品或研究人员希望在单帧中观察的视野决定的。

因此，作者选择首先定义光片长度的方法，然后根据它们提供的轴向分辨率和光学切片来比较光片。

将高斯光束设为参考值，作者计算了相同光束长度下不同光束类型在厚度和光学切片方面的相对增益或损失。

图2显示了长度为30 µm的光片的结果。数值超过100%表明光片厚度 wOS 或主瓣宽度wML大于高斯光束。

总体而言，作者发现对于所有光束类型，在这两个特性之间存在权衡：制造薄光片会以高斯光束的长度或其他光片类型的光学切片为代价。

光片显微镜的技术选择是一个综合考量的过程，需要在分辨率、对比度、光切片质量和激光强度之间找到最佳的平衡点。通过深入理解这些技术参数及其相互关系，您可以更加自信地选择和优化适合自己研究的光片显微镜技术。

光片模拟软件软件

作者的光片模拟器应用程序*数值计算光片的 3D 强度分布并量化其尺寸。它可以生成高斯光束、聚焦平顶光束、艾里光束、贝塞尔光束、贝塞尔光束晶格、双光束和球差光束，以及用户引入的任意类型光片。该算法将光束在后焦平面的电场幅度和相位作为初始条件，使用光束传播方法计算其在焦平面周围的传播。

* E. Remacha “Light Sheet Simulator” (2019) [retrieved 5 November 2019]

https://github.com/remachae/beamsimulator

操作步骤

在Matlab环境中运行LightSheet_Simulator.mlapp，图3显示了GUI示例。有三种可能的操作：

仿 真

允许可视化光片的截面以及后焦平面的强度和相位。要模拟本文讨论的光片，请在选项卡面板中选择光束类型并输入所需参数。要模拟自定义光片，请选择“创建光片”选项卡。输入包含后焦平面幅度和相位的文件路径。这些文件必须以 tiff 格式提供。

分 析

在模拟光片后，按“分析”以获得本文定义的主瓣宽度wML、光学切片厚度 wOS 和长度L 的值。

保 存

在指定的目录下创建文件 simulated_lightsheet.m。该文件包含 3D 强度矩阵以及计算中使用的数值和物理参数。

图3. 光束模拟器用户界面

图3展示了光束模拟器的用户界面，通过这个界面，用户可以选择不同类型的光束进行仿真，分析结果，并保存数据。