解析显微镜视场数(RFN)

A Performance Measure for Confocal Imaging

光学显微镜的视场数(FN)表示视野大小(FOV)。它对应于中间图像中通过目镜可以观察到的区域。虽然我们不能一次观测到很大的视野,但人眼可以扫描并整合整个视野的结构特征。重要的是,该领域的大小和分辨率适合人眼能力。

摄像头有固定的观察视野,不能扫描显微镜光学系统的全视野。因此,必须减小视野(通过插入额外的光学元件),以便可以将图像投影到摄像头传感器上而不会造成损失。

在扫描显微镜中,像真正的共聚焦激光扫描显微镜一样,FN表示可以扫描样本的最大区域,但实际的扫描过程必须设置正确的参数,否则可能会丢失分辨率。这种情况通常意味着应观察较小的视野或使用非常大的图像格式。为了比较这些限制,引入了一个修改的视场数(RFN)。RFN是指最大解析视野。

视场数(FN)

显微镜中的视场数(FN)定义为中间像面上可通过目镜观察到的区域的直径。视场数(例如20 mm)表示通过物镜放大后观察到的样本区域的直径限制为20 mm。如果物镜的放大倍数为40倍,FN为20 mm,则可以观察到直径为500μm的样本区域。


公式1

其中dfield是观察样本面积的直径,Mag是物镜的放大系数。

通常放大倍率值刻在镜筒上,视场数刻在目镜筒上。有了这些信息就可以计算出当前观察到的FOV直径:


公式2

对于宽场显微镜,FN由目镜中金属光阑的直径决定。由于所有光学系统都会导致远离透镜中心的光学像差增大,因此其尺寸的设置可确保在观察范围内获得良好的图像质量。尽管如此,“良好质量”的定义仅针对场(1)的平坦度进行标准化,留下了讨论其他像差的空间。

共焦扫描

在共焦扫描显微镜中不会生成类似这种的中间图像。事实上,针孔位于中间图像平面。通过针孔的荧光信号强度随着扫描的进行不断变化,这些信息重组后形成了图像每一帧图像的存储与样本中焦点的位置同步。帧的预定义大小为x乘以y图片元素(像素)。元组(x,y)称为扫描格式,有时称为扫描分辨率(不要与光学分辨率(2)混淆)。

因此,共聚焦显微镜的计算FN是样本的扫描视野大小乘以放大倍数。中间图像在成像过程中不会出现。通过调整扫描振幅,可以将观察到的场从最大值变为零(3)。零振幅意味着在样本中观察到一个单一的固定点,这是荧光相关光谱(FCS)所要求的。中间振幅产生小于最大值的视野,构成放大功能,因为较小的视野显示在相同的监视器尺寸上,因此表示额外的“放大”(而不是光学放大)。

光学分辨率

光学分辨率(dA)可用Abbe公式确定:



公式3

式中dA是两个可以分开的无穷小的“点”物体的距离,I是照明光的波长,NA是物镜的数值孔径。显然,透镜的放大率对光学分辨率没有影响。

当扫描样本并将强度信息存储到数字图像中时,为了保持光学分辨率,从样本投射回来的图像元素的大小应小于光学分辨率。否则,数字图像比光学图像具有更少的信息。通常,我们假设一个½倍dA的因子作为适当的过采样(特殊的图像恢复算法通常需要更高的过采样,最多四倍)。因此,所需的最小像素大小(dp)可以计算为:


公式4

解析视野

共聚焦扫描显微镜的能力进行特征分析时不适合以光学校正的整个区域来探讨FOV,而应当以可能进行扫描而不会损失光学分辨率的区域来进行探讨。利用最大可行的矩形扫描格式(x,y)max,我们就可以计算出所解析的视野大小(dsc res):


公式5

例如,假设λ=500 nm,NA=1.4,则dp=90 nm。如果扫描格式为x=y=1000像素,则该场将覆盖90×90μm的视野。

如果我们使用放大率为63倍的透镜,那么计算的视野(FN的方程1)将对应于中间图像平面中5.6 mm×5.6 mm的区域。这个正方形的直径只有8 mm,比显微镜设计的典型FN小得多。

将公式5乘以所用透镜的放大系数,我们得到一个等于FN的量,但现在考虑到实际的扫描条件。我们称之为解析视场数RFN:


公式6

举例:

我们假设显微镜的FN为22 mm(图1,左)。我们使用放大倍数为40x,NA为1.3的物镜,光波长为500nm,扫描x=y=2496像素的正方形(考虑到仪器可以扫描的最大值)。RFN等于13.6 mm。

在第二个例子中,我们假设显微镜的FN为25 mm(图1,右)。使用相同的透镜(40x/1.3)和光波长(500nm),但仪器的最大尺寸限制为1024像素。根据方程式6,我们计算出RFN为5.6 mm。尽管在这个例子中,FN看起来上比前一个例子要大一些,但是可用的扫描区域要小得多(如果不接受分辨率损失)。

[Translate to chinese:]FN&RFN

图1:FN=22 mm,RFN=13.6 mm,2496个像素(左)。FN=25,RFN=5.6 mm,1024个像素(右)。

参考文献

ISO19012-1 Microscopes--Designation of microscope objectives--Part 1:Flatness of field/Plan

www.iso.org/standard/61652.html

Super-Resolution–On a Heuristic Point of View About the Resolution of a Light Microscope

www.leica-microsystems.com/science-lab/super-resolution-on-a-heuristic-point-ofview-about-the-resolution-of-a-light-microscope/

Smart Control for Resonant Galvo Scanners

www.leica-microsystems.com/science-lab/smart-control-for-resonant-galvo-scanners/


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