TauSense——让自发荧光不再成为负担

自从徕卡全新的STELLARIS系列共聚焦发布以来 ，无论是便捷的操作体验还是超高灵敏度的POWER HyD S家族检测器以及更宽调节范围的白激光都给各位老师留下了深刻的印象，而基于荧光寿命成像技术的TauSense模块更是为老师们打开了成像领域的另一扇大门，使得以往的不可能成为了可能。为什么TauSense有如此强大的功能呢？我们先来简单回顾一下什么是荧光寿命成像。

什么是荧光寿命成像？

荧光分子受到特定激光激发后，从基态跃迁到激发态，再以辐射跃迁的形式发出荧光并回到基态，荧光分子停留在激发态的时间就叫做荧光寿命（图1）。从激发光开始照射样品到检测器探测到光子的这段时间称作“光子到达时间”，样品的“荧光寿命”与“光子到达时间”呈正相关，而一个像素点中包含多个光子，多个光子到达时间的平均值（Average Arrival Time, AAT）就可以反映该像素点的荧光寿命信息。TauSense就是一个基于AAT的检测模块，能够让各位老师快速地获取到荧光寿命图像。

图1：荧光激发示意图

为什么我们还需要荧光寿命成像呢？

激光共聚焦荧光强度成像是一项非常成熟的技术，为什么我们还需要荧光寿命成像呢？荧光寿命是荧光物质的固有属性，与染料浓度、激发光强度等因素无关，取决于染料内在性质以及所处的微环境，因此相比于荧光强度成像，荧光寿命成像会更加稳定，并能同步获取更多维度的数据信息。接下来本文将以自发荧光为例，使您对TauSense有一个更加直观的了解。叶绿体的自发荧光强度高、分布广，对目标信号会造成非常大的干扰，在植物学领域内一直是一个无解的难题，例如图2为拟南芥叶片常规的荧光强度成像，我们既可以看到叶肉细胞，也可以看到叶绿体，这些叶绿体的荧光信号就同橡皮糖一样甩也甩不掉，让人无可奈何，最终只能妥协。但有了TauSense成像模式之后（视频1），我们可以根据荧光寿命瞬间识别出这两种不同的成分（叶绿体 ：1.73 ns；叶肉细胞：2.69 ns），不但能提高图像的反差，从而进行叶绿体计数实验，而且还能直接将叶绿体的信号从原图中扣除，一举两得。

图2：拟南芥叶片荧光强度成像

拟南芥作为模式生物，在植物学研究中有着非常广泛的应用。视频2中的样品为拟南芥花药，当使用485nm激发光进行激发时，会将花粉粒和药隔等结构同步激发而呈现出一片绿色。然而根据荧光寿命的差异，可清晰地呈现出不同结构，便于进行后续的组分拆分。

进行局部放大后，对单个花粉粒进行3D成像（视频3），常规荧光强度模式下（左）能够很好地获取整个花粉粒的三维形态，而在TauSense成像模式下，可直观地看出花粉壁（红色，0.5ns）和花粉内含物（蓝色，2.3ns）。

使用TauSeparation功能，我们可以将这两种不同寿命的结构进行拆分（视频4），拆分出来的花粉壁结构清晰可辨，甚至能够看到花粉壁的萌发孔（左），这将帮助各位老师更加精确地进行分析和研究。

对于光谱重叠的信号，TauSense同样能发挥巨大的作用，图3为车前草叶片的下表皮荧光强度成像，我们能清楚地看到这里有两种不同的结构，但由于这两种结构的发射光谱重叠，所以在拍摄时这两种结构会同时呈现，彼此之间互相干扰。而在TauSense成像模式下，这个问题就迎刃而解了，从视频5中我们可以看出，虽然这两种结构的发射光谱完全一致，但它们具有不同的荧光寿命（栅栏组织 ：0.2 ns；输导组织：1.6ns），通过荧光寿命成像，我们就可以非常轻松地将这两种结构区分开。

图3：车前草叶片下表皮荧光强度成像

在动物组织样品上，TauSense同样有着不俗的表现。图4为小鼠的肾脏组织切片，由于制样时的操作失误，引入了许多组织碎片，而这些碎片产生的强烈自发荧光对关键部位成像造成了很大的干扰。在TauSense成像模式下（视频6），根据荧光寿命的差异可以很准确地将这些碎片识别出来并剔除，保留了目标信号，从而避免了重复制样，大大提高了实验效率。

图4：小鼠肾脏切片荧光强度成像

血管壁具有丰富的弹性纤维与胶原纤维，从而会产生很强的自发荧光，但即使是人见人厌的自发荧光，当遇到了TauSense，也会摇身一变发挥出巨大的作用。例如在小鼠肾脏组织切片中（视频7），血管壁与其余组织结构的自发荧光寿命就有着很大差异，利用这种差异我们可以将其进行拆分或剔除，从而更有针对性地进行研究。