冷冻替代的简要介绍

冷冻替代是一种在足够低温的条件下进行的脱水过程，以避免形成冰晶，并有效规避在环境温度下脱水后观察到的破坏性影响。在冷冻替代期间，“冷冻”水被有机溶剂溶解，有机溶剂通常也含有化学固定剂[1]。冷冻替代与细胞成分的即刻物理固定（冷冻固定）以及树脂包埋相关联。一旦替代完成，样品会逐渐升温，并与常规制备的样品一样进行进一步处理。与化学固定技术相比，成功的冷冻固定及后续FS处理显示出优良的精细结构保存[2]。即使在非常低的温度下，大分子在有机溶剂中的聚集和生物分子周围水合膜的变化也可能发生，但可以合理地假设，在低于特定阈值的温度下，FS可以保持水合膜[3,4]。

此项技术还使通过ET检查厚（200–300 nm切片）样本成为了可能，因此相对较大的细胞体积可以在3D形态下获得研究。这种方法非常有利于理解不同细胞器与随机事件之间的复杂关系。

图1：酵母（酿酒酵母）。感谢荷兰乌特勒支大学van Donselaar EG, Humbel BM；荷兰乌特勒支大学医疗中心Slot JW提供的图片。

高压冷冻和冷冻替代拟南芥根尖细胞的电子显微镜观察

感谢：de Rycke R

用于形态分析的HPF – AFS实验方案

将拟南芥根（突变体PIN1pro：PIN1-GFP；bex5-1）切下，浸泡于20%（w/v）BSA当中并立即在高压冷冻仪（Leica EM PACT）内冷冻。

冷冻替代则使用Leica EM AFS2在含有1%ddHO、1%OsO4和0.5%戊二醛的干燥丙酮内进行，共持续4天，具体条件如下：

–90℃下持续24小时，
每小时递增2℃，持续15小时，
–60℃下持续24小时，
每小时递增2℃，持续15小时，以及
–30℃下持续24小时。

然后在–30℃到0℃之间使用纯丙酮对样本进行3次清洗再缓慢加热到4℃，然后在4℃下逐步渗透3天至Spurr树脂中并包埋于胶囊内。在70℃下进行16小时的聚合处理。

使用超薄切片机（Leica EM UC6）制作超薄切片，然后在Leica EM AC20切片染色机当中使用20℃的乙酸铀酰进行40分钟的后染色，再使用20℃的柠檬酸铅进行10分钟的后染色。使用JEM 1010透射电子显微镜（JEOL, 东京，日本）在80kV电压下用来自Ditabis（Pforzheim, 德国）的图像板技术观察网格。

详细内容见参考文献[5]。

图2：在PIN1pro::PIN1=GFP；bex5-1当中使用50 uM BFA处理1个小时后得出的拟南芥初生根细胞超微结构。

高压冷冻和冷冻替代小鼠心脏组织的免疫电子显微镜观察

感谢：de Rycke R

小鼠心脏组织免疫电镜的HPF – AFS实验方案

将野生型（WT）小鼠和αT-连环蛋白基因敲除型（KO）小鼠的心脏组织切下，浸泡于20%（w/v）BSA当中并立即在高压冷冻仪（Leica EM PACT）内冷冻。冷冻替代则使用Leica EM AFS在含有2% ddH2O和0.1%戊二醛的干燥丙酮内进行，共持续4天，具体条件如下：

–90℃下持续24小时，
每小时递增2℃，持续15小时，
–60℃下持续24小时，
每小时递增2℃，持续15小时，以及
–30℃下持续24小时。

然后在–30℃到0℃之间使用纯丙酮对样本进行3次清洗再缓慢加热到4℃，然后在4℃下逐步渗透3天至Spurr树脂中并包埋于胶囊内。使用紫外灯在Leica EM AFS当中进行聚合处理，持续6天，起始温度20℃，结束温度37℃。

使用超薄切片机（Leica EM UC6）制作超薄切片，然后在Leica EM AC20切片染色机当中使用20℃的乙酸铀酰进行40分钟的后染色，再使用20℃的柠檬酸铅进行10分钟的后染色。

使用JEM 1010透射电子显微镜（JEOL, 东京，日本）在80kV电压下用来自Ditabis（Pforzheim, 德国）的图像板技术观察网格。

按照之前所述进行免疫标记处理和标记定量[6]。

免疫-EM使用以下一级抗体：

Cx43-多克隆兔抗体（1:50；Sigma）和
结蛋白多克隆兔抗体（1:50；AbCam）。

在Li等人[7]的文章当中还显示了经处理（使用Leica EM PACT和Leica EM AFS进行处理）用于Spur树脂包埋和HM20（使用Leica HPM010）的其他图像。

图3：αT-联蛋白连环蛋白KO基因敲除型（KO）小鼠心脏间盘（ICD）代表性接缝处经银放大的Cx43单一免疫学金标记。

图4：野生型小鼠心脏间盘（ICD）代表性接缝处经银放大的Cx43单一免疫学金标记。

图5：αT-连环蛋白基因敲除型（KO）小鼠心脏桥粒内结蛋白的单一免疫学金标记。

图6：αT-连环蛋白基因敲除型（KO）小鼠心脏桥粒内结蛋白的单一免疫学金标记。

受肺炎衣原体感染的Hep-2细胞

感谢：Kaech A

实验方案

感染肺炎衣原体的Hep-2细胞在碳涂6mm宝蓝色培养皿当中进行了培养。细胞在使用6 mm CLEM中间孔板的Leica EM HPM100当中进行高压冷冻，其设置如下：含有细胞的宝蓝色培养皿，间隔片200 µm，无细胞宝蓝色培养皿，2片间隔片200 µm。冷却之前使用乙醇作为同步化液体在室温下转移压力。冷冻后将宝蓝色培养皿从浸泡在 –90℃的无水丙酮中的中间孔板内取出并立即移入含有2% OsO4无水丙酮的2 ml Eppendorf试管内，在Leica EM AFS2冷冻替代仪当中预先冷却至–90℃。

样本置换条件

–90℃下置换8小时
-60℃下置换8小时，
-30℃下置换8小时，以及
0℃下置换1小时

期间的周期性温度转变梯度为30℃/h。然后使用4℃的无水丙酮清洗2次，在4℃的33% Epon/Araldite无水丙酮内连夜浸泡，而后在4℃的66% Epon/Araldite无水丙酮内浸泡6小时，最后在室温下浸泡于100% Epon/Araldite内2小时，全部浸泡结束后才移入1.5 ml Eppendorf 试管内在60℃下进行至少24小时的聚合处理。使用乙酸铀酰和醋酸铅对切片进行后染色。

注：在蓝宝石片上培养的单层细胞在高压冷冻时不需要使用乙醇作为同步流体。可以使用一种简单的三明治结构来获得类似的结果，即将宝蓝色片置入CLEM中间孔板内，细胞面朝上，盖上一片浸润有1-十六碳烯的铝样品盘，铝盘的100 µm空腔面朝向细胞。