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活细胞成像简介

活细胞成像是指主要用于捕获活体、活动状态的细胞图像的技术，得到的细胞图像可以是单个静态图像，也可以是延时系列图像。随着电子、数据处理、光学和荧光标记技术的进步，活细胞成像技术的功能更为丰富、成本更低、更易于使用，因此近些年来它的应用也显著提升。

活细胞成像的技术应用大致可以分为两类:

>细胞在存活状态下的图像记录一一因固定或终止不同活体过程而产生千扰性伪影。

>实时观察细胞、组织或整个生物体在其自然环境中的动态过程。

如果需要实时跟踪细胞器或分子水平的生理活动，那么采样率，也就是这种情况下的帧率，必须足以匹配这些生理活动的进展速度。生理活动的进展速度存在巨大的差异，有的只有几毫秒，例如在钙成像中或对线粒体网络中的变化进行观察时。

在任何成像实验中，为获得真正有价值的观察数据，还必须对细胞的健康和稳定性给予同等的重视。在活细胞成像中，这就需要优化细胞培养基、细胞培养或观察容器、无菌技术，并尽量避免光毒性。细胞活性是实现成功的活细胞成像的关键要素，因此我们将在下一个部分介绍为保持细胞活性而需要考虑的各种参数。

细胞培养基

哺乳动物细胞必须培养在37*C的恒定温度下。另外，细胞新陈代谢过程中，它们的新陈代谢产物还会降低细胞培养基的pH值。为了中和代谢产物引起的培养基酸化，保持pH7.4的稳定，培养基中通常使用碳酸氢盐(HCO3-)和溶解二氧化碳(CO2)作为缓冲系统，后者来自于细胞培养箱中5%的大气二氧化碳。如果没有可用的CO2，也可以使用含有10-20 mM HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)的缓冲液(一种双离子有机化学缓冲液)。苯酚红是一种常用的pH值监测方法，在6.8到8.2的pH值范围内，颜色会逐渐从黄色变为红色，pH值超过8.2时会变为粉色。在活细胞荧光成像中，应将细胞放在无酚红培养基中，因为含酚红培养基可形成强烈的荧光背景，降低成像对比度。

适当的培养基成分对于细胞的体外存活也至关重要。培养基成分主要包括葡萄糖、丙酮酸钠、氨基酸、维生素和无机盐。对培养基无特别的规定时，通常将胎牛血清(FBS)作为蛋白质、脂质和生长因子的来源。

细胞培养容器

从96孔板到大尺寸容器，细胞培养容器的大小各异。塑料底容器可用于低放大倍率的显微镜，但如果是高放大倍率的投入式物镜，必须使用特定衬度和折射率的玻璃底容器。在常规的培养容器中对细胞进行成像可能会导致折射率不匹配，并因分辨率、像差和对比度降低而造成图像劣化。另外，制造培养容器时使用的一些材料在特定激发波长下可能会产生自发荧光。选择培养容器时，需要综合考虑细胞在塑料上的择优生长，还要考虑使用玻璃时使用多聚小赖氨酸或多聚鸟氨酸等基质进行包被的需要。

很多制造商的细胞培养容器中都提供兼顾成像参数的细胞健康成长相关的解决方案。其中包括可以粘附择优基质的吸附培养容器，或使用聚合物制造的具有特定折射率的容器。

无菌技术

无论是否用于显微镜，无菌性始终是细胞培养应用的一个前提条件。

细菌污染是一种始终会存在的风险，因此，细胞培养基中通常会添加抗生素(1)。使用核纤层蛋白B(品红色)对核结构染色的C2C12细胞，Hoechst (蓝色)表示DNA，H2AX(黄色)表示DNA损伤。使用配置63X/1.4油浸入式物镜的THUNDER Live Cell Culture对细胞进行成像。上图显示了17.47mm厚Z-堆栈扩展景深的投影。图片来源:Lucas Smith博士，加州大学戴维斯分校生物科学学院神经生物学、生理学和行为学系。

最常用的细胞培养抗生素方案是盘尼西林和链霉素。盘尼西林可以破坏细菌壁合成，链霉素可以干扰蛋白质的生物合成并造成细胞死亡。有时，有些案例会要求避免使用抗生素，例如在一些胚胎干细胞培养中(2)，在这些情况下，更需要小心保持无菌条件。对细胞进行活体成像时，必须要满足一系列条件，确保维持细胞健康，并满足适当的成像条件。