免费下载《如何成功进行活细胞光电关联》
简介
Coral Life 工作流程提供了一种简化的活细胞CLEM解决方案，用于深入了解细胞成分随时间发生的结构变化。除了工作流程手册中描述的技术处理外，本文还提供了成功进行实验的其他知识。
在本例中，主要关注点是两个有丝分裂细胞的最终分离，即脱落。细胞分裂后，两个分裂细胞只通过细胞间桥相连，而这一间桥需要进一步研究。由于其体积庞大，活细胞成像无法完全了解这一机制。因此，需要通过超微结构分析来了解最终细胞分离的内在机制。
蓝宝石的制备
6毫米蓝宝石盘需要在实际实验前进行清洁。清洗步骤如下:
1.在通风橱中将蓝宝石盘放入浓盐酸(HC1 30%)中浸泡2小时。
2. 用双蒸(dd)H20冲洗蓝宝石盘3次，每次5分钟。
3.之后将蓝宝石盘放在滤纸上晾干。
清洗过程结束后，需要在干净的蓝宝石盘上喷镀出网格图案。这一步至关重要!该图案可确保日后在树脂块中轻松检索样品位置和感兴趣的区域。在蓝宝石上绘制图案的步骤如下:
1. 将一个干净的蓝宝石盘放入镀膜安装座的每个相应位置，并在上面添加一个6毫米的finder栅格掩模(图1)。Finder 栅格掩膜外围有一个凹槽，用于指示掩膜的方向。所有掩膜应具有相同的方向，以便在后续步骤中始终显示蓝宝石的正确方向。建议将finder光栅掩模放在能产生可读字母的方位。
图1:蓝宝石上用于后续喷镀的finder栅格掩模的方向
2. 对于掩膜的喷镀，可以使用金或碳。在此，使用EMACE600碳线以脉冲模式(双线、100毫米距离、210瓦、150 毫秒脉冲长度)进行碳涂层。在蓝宝石上沉积了厚度为10纳米的碳层。
>确保关闭旋转。这将使网格图案更加清晰。
>根据镀膜仪和喷镀技术的不同，可能需要喷镀更厚的碳层才能获得良好的可见度。
>如果使用碳，不要忘记将碳层稳定在180摄氏度以上过夜。
3.现在蓝宝石已准备就绪，可以按照工作流程手册(参考第5.1节)的说明设置SampLink chamber。确保碳层朝向SampLink chamber的内部。细胞需要在碳层顶部生长。
如何成功进行活细胞光电关联
在将细胞种植到组装好的SampLink细胞室之前，需要再次对细胞室进行清洁和灭菌。在细胞培养罩中执行以下步骤:
1.在细胞室中注入1毫升70%乙醇并孵育5分钟。
2.用 dd H2O 冲洗3次。
3.让其干燥过夜。
4. 紫外线灭菌至少1小时。
第二天:
1.用PBS 冲洗3次。
2. 加入1毫升PBS 或培养基，将培养室放入培养箱中过夜。After培
3.养结束后用dd H20冲洗。
培养皿即可使用。将细胞直接种在蓝宝石上，或种在附加的聚合物或多肽涂层上。在这里，蓝宝石上的碳网格图案上涂有聚-L-赖氨酸(broidP1274，分子量70,000-150,000，Sigma-Aldrich)。涂层用0.1mg/mlddH20稀释。在每块蓝宝石上加入50μl5分钟，然后冲洗(3次ddH20)，并在通风橱中干燥2小时。
细胞孵育
这些实验使用了在DMEM培养基(10%FCS ，1%青霉素/链霉素)中培养和孵育的HeLa Kyoto HKF1、H2B-mCherry、alphaTubulin、mEGFP细胞系。
1.每个 SampLink chamber培养66,000个细胞，在37℃、5%C02条件下培养24小时。
>在标准细胞培养箱中，将6个开放的SampLinks放入140毫米的培养皿中，然后盖上培养皿。在实际成像实验之前，需要将SampLinks完全组装好。按照Coral Life手册第5.2.4节的说明组装SampLink室。
>如果直接在OxyGenie中培养SampLinks，则需要在播种后直接组装SampLinks chamber.
注意:OxyGenie需要30分钟左右加热。
2.在这些实验中，培养24小时后细胞的密度达到约70%。
