STELLARIS用户交流会北京站回顾
李叶昕、蒋玉丽
十一长假过去了，大家还记得我们的STELLARIS吗？节前STELLARIS又又又开了一场用户会，此次会议选址北京，邀请了众多Leica的资深用户，他们就自己的研究方向与Leica显微技术在诸多研究领域的应用等内容进行了多学科探讨，并亲自上机感受STELLARIS和THUNDER。
开幕式上，生命科学市场经理李伟晶对各位专家的莅临表示了欢迎，回顾历史，徕卡始终秉持以前沿科技为导向，实现应用转化，以助力用户推动科学发展。
▲生命科学市场经理李伟晶
应用团队为Stellaris揭开神秘面纱，向与会的专家们介绍了产品的性能与应用。
▲应用团队为Stellaris揭幕
并通过分组操作的方式让专家们亲身感受革命性升级带来的全新体验。
▲与会人员上机感受STELLARIS
会上老师们分享了自己的研究成果与心得体会，我们一起来回顾下。
讲题一：生物大分子相分离概述
报告人：吝易 清华大学生命科学学院
生物大分子相变（Phase transition）是物理学与生物学相交叉的一个新兴的研究领域。相变在生物体内普遍存在。一些无膜细胞结构如核孔复合体、纺锤体的形成就是由特定组分的相变过程驱动的。生物大分子相变可导致某些蛋白质构象改变或非正常聚集，造成不可逆的神经损伤，导致某些神经退行性疾病如阿茨海默病的发生。
PRn多肽是神经损伤的重要因素。过量表达PRn多肽会导致细胞死亡及组织退化。吝老师团队发现PRn多肽在细胞内的受体为一类包含有低复杂序列的蛋白。通过多种生化实验证实PRn多肽直接与这类蛋白的低复杂序列结构域相互作用。富含低复杂序列结构域的蛋白在生殖分裂、神经分化和应激条件下会大量聚集。体外分离这类低复杂序列片段发现它们会发生液滴样与水凝胶样的相变。将PRn多肽标记荧光进行高分辨成像发现其特异地结合在核孔复合体的中间部位，即低复杂序列片段富集区。这种结合一方面导致某些信使RNA不能通过核孔运输到细胞质中指导蛋白质翻译，另一方面导致一些细胞周期相关蛋白无法进入细胞核，进而产生细胞毒性。通过水凝胶结合试验，发现某些氨基酸的磷酸化状态可能影响低复杂序列蛋白的相变转换，从而为解决神经细胞内的蛋白质非正常聚集提供了一个思路。
▲吝教授
讲题二：超分辨：新维度带来新认知
报告人：席鹏 北京大学工学院
在生物学发展过程中，显微成像技术帮助人们不断发现微观世界的奥秘，直接促进了细胞生物学的突破性发展。长期以来，由于光的衍射限制现象，200nm一直被认为是光学显微技术的极限。受激发射损耗（STED）技术通过一束高强度的环形光提供受激辐射来突破这一极限。
▲席教授
席老师长期致力于超高分辨成像技术在生物学中的改进与应用。镜面增强技术（MEANS）通过在样品上方增加一面反射镜，将简单的反射面引入生物显微样品中，当光到达镜面后，反射波和入射波相互干涉形成一层100nm的干涉增强层，将成像平面限制在这一区域。当MEANS技术结合STED时，在不增加激光强度的前提下，可以实现分辨率两倍的提升，最高达到19nm，成功观察到了细胞核孔复合体中的孔状结构和人类呼吸道合胞体病毒hRSV-F蛋白包裹hRSV-N蛋白的现象。
线粒体是细胞内的能量工厂，线粒体嵴的动态变化对于研究一些线粒体相关病理过程至关重要。然而，传统的线粒体示踪染料很容易被STED技术较高的激光漂白。席老师与深圳大学屈军乐老师课题组合作开发了新型的线粒体示踪染料MitoESq-635。这个染料可以在非常低的功率下实现STED受激辐射光束的擦除效果。利用这个优势，该工作首次实现对线粒体长达50分钟的动态观测。与常规共聚焦相比，该工作在35.2nm的空间分辨率、0.66秒每帧的时间分辨率下观察到了线粒体嵴的动态变化，且所有观测到的线粒体嵴结构形态与扫描电镜的结果一致。
对于超高分辨技术的发展方向，席老师提到徕卡STELLARIS拥有新一代更灵敏的HyDS检测器，可以用更低的激发光实现更长时程的成像。荧光寿命门控技术Taugating可以从荧光寿命维度将MEANS技术的反射光去除。基于荧光寿命的差异，Tau-STED可以将自发辐射信号与受激辐射信号区分，进一步提高STED的分辨率。
讲题三：荧光寿命成像技术应用新进展
报告人：何其华 北京大学医学部医药卫生分析中心
北京大学医学部医药卫生分析中心生物成像室何其华高级工程师作了题目为《荧光寿命成像技术应用新进展》的精彩报告。
何老师从荧光的主要特性参数（激发/发射光谱，量子产率，荧光淬灭和漂白）谈起，引出荧光的指纹参数—荧光寿命的概念，并介绍了和共聚焦结合的荧光寿命成像技术TCSPC（时间相关单光子计数法），及相应检测设备的核心部件。她特别提到传统FLIM检测设备的死区时间长、成像设备复杂、成像速度慢，限制了FLIM的广泛应用，而徕卡新的FALCON（快速荧光寿命成像）可以做到每个脉冲记录一个光子，FLIM成像速度相比传统设备提高了10倍以上，使得实时FLIM检测成为可能。
最后何老师还就FLIM的各类应用进行了详细的介绍。利用 FLIM 进行活细胞和活体微环境改变的检测，例如钙离子浓度、PH值及钠离子的检测；利用FLIM-FRET进行蛋白和蛋白相互作用，蛋白和核酸相互作用，蛋白寡聚化和构象变化的研究；并着重探讨了利用NADPH/NADH/FAD的自发荧光进行双光子荧光寿命检测来研究活体和活细胞的代谢，并列举其在各类代谢相关疾病(神经退行性疾病、肿瘤，糖尿病和心血管疾病)中的实际应用。比如利用NADH的荧光寿命成像来分析胶质瘤肿瘤细胞亚群TMC及STIC功能的不同；利用Phasor plot分析阿尔茨海默症不同小鼠模型中NADH荧光寿命的差异等。
▲FLIM在肿瘤研究中的应用前景
讲题四：centrosome architecture under sub-diffraction resolution
报告人：傅静雁 中国农业大学生物学院
傅老师首先向大家介绍了中心体结构及其在细胞分裂、细胞命运决定、细胞信号通路、细胞迁移中的多种角色。中心体与人类健康息息相关，中心体过表达会导致肿瘤；中心体蛋白突变会导致头小畸形病；各类纤毛病均与中心体蛋白突变有千丝万缕的联系。那么探究不同状态下的中心体蛋白结构的改变，则非常有意义。把中心体结构蛋白画出来，这就是傅老师最开始的想法。中心体的核心结构中心粒是由9个三联体微管组成的高度对称的圆柱体结构。目前已知多种中心体蛋白。但由于中心粒结构小于200nm，必须借助超高分辨显微技术来研究中心体蛋白超微结构。
傅老师运用徕卡STED纳米显微成像设备，解析了中心粒Ⅰ区核心蛋白Sas-6的结构，分辨率达50nm。并研究了多种中心体蛋白的超微结构，发现一部分中心体蛋白为延展性蛋白，呈九轴对称骨架结构，另一部分蛋白为非延展性蛋白，呈同心圆形式分布。并且研究了中心体蛋白的时间募集过程。通过在时间和空间维度上对中心体蛋白的研究，为下一步研究蛋白之间的相互作用，细胞分裂过程中中心体蛋白的调控奠定了基础。
▲傅教授
此次会议内容精彩纷呈，气氛热烈活泼，与会人员收获满满，一天的会议时长尤嫌不足。STELLARIS将在国内多个城市巡展，这里是否有您所在城市呢？赶紧联系您身边的Leica工作人员加入我们吧！
