徕卡电镜解决方案 —— 让病毒无所遁形

徕卡显微系统 应用专家 肖丽国

2020年，似乎来得更艰难一点。从去年12月份开始，新冠肺炎疫情（COVID-19）就像龙卷风一样席卷全球，当前已在217个国家地区蔓延，全球确诊超2402万例，死亡破82万例。新冠肺炎疫情构成大流行的威胁“已经变得非常真实”。

WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Overview

数据来源：World Health Organization，Date by 2:44pm CEST, 27 August 2020

疫情之下，奔跑在一线的有我们的白衣天使，也有争分夺秒的科研人员。而在整个疫情的防控防治过程中，电镜技术，让病毒无所遁形。

负染色技术—鉴定病毒形态

为什么是冠状病毒？

电镜给了一个很重要的指标：病毒形态。

1月6日，中国疾病预防控制中心通过对临床患者分离毒株样品进行电镜负染色，发现了病毒的存在，且形状与冠状病毒相似，直径80-120nm，表面有皇冠一样的突起，这就给我们一个很重要的方向指示。随后，根据核酸序列比对以及其他鉴定方法，宣布新型冠状病毒肺炎疫情爆发。

图片来源：中国疾病预防控制中心

负染色技术可以鉴别病毒形态、纯度和浓度

负染技术流程简单，检测速度快。一般几分钟就可以完成。

载网要求：

1、载网亲水：商业化载网表面有油脂，悬液样品铺不开

2、碳膜载网：促进样品颗粒均匀分布

徕卡高真空镀膜仪，一机两用：镀膜+辉光放电

EM ACE系列镀膜仪（Leica EM ACE200）

负染技术—徕卡解决方案

冷冻电镜技术—指导药物和疫苗设计

新冠病毒表面的S蛋白，是侵染宿主的关键蛋白，与SARS病毒S蛋白一样，都将宿主细胞表面的“血管紧张素转化酶2（ACE2）”作为侵入细胞的关键受体。了解S蛋白的结构，弄清楚S蛋白与ACE2的作用方式，是药物开发和疫苗设计的重点。

2月15日，德克萨斯大学奥斯汀分校McLellan团队获得了新冠病毒S蛋白三维结构，分辨率达3.5埃，确定了该S蛋白是由S1和S2组成的三聚体。RBD是受体结合区域，存在多种构象状态。与SARS病毒S蛋白比较，两者是不同的，但整体上仍具有较高的相似度。

随后，作者又分别分析了两个病毒S蛋白与ACE2的亲和力，新冠病毒S蛋白与ACE2的KD（平衡解离常数）是14.7nM，SARS病毒S蛋白与ACE2的KD是324.8nM，KD越高，亲和力越低，暗示着新冠病毒的传染性要高于SARS病毒。

3月1日，华盛顿大学David Veesler团队根据S蛋白存在多种构象，重构了3.0埃的close构象，以及3.3埃的打开单个SB区的三聚体。

结果表明，新冠病毒S胞外区表现为一个16nm长的三聚体，三角形截面，与SARS病毒S蛋白非常相似。很多序列是保守的，设计针对这一结构功能的抗体，可能会交叉反应中和这两种病毒以及其他相似的冠状病毒。

同时还发现S1和S2边界处存在四个氨基酸残基插入，从而引入了新的蛋白酶切位点。这就可能会增强病毒的可传播性，更加科学地解释了新冠病毒传染力强的问题。

2月19日，西湖大学周强教授团队获得了ACE2的全长三维结构，同时解析了S蛋白RBD和ACE2的复合物三维结构，看清楚了它们的相互作用方式，这一步正式揭开了新冠病毒入侵人体细胞的神秘面纱。

“S蛋白像一座桥横跨在ACE2表面，又像病毒的一只手，紧紧抓住ACE2，打开细胞大门”。

了解了锁的结构，接下来，就可以有针对性地设计钥匙，设计药物和指导疫苗的研发。

技术流程与负染类似，但是样品最终要经过投入冷冻，在低温电镜下进行观察。

徕卡的EM GP2，就是一款专业的投入冷冻仪，通过对样品的单边或双边的平行吸附，实现样品的快速均匀冷冻。包括生物样品，工业溶剂、悬浊液、乳浊液、胶体样品等。

冷冻电镜技术—徕卡解决方案

结果展示：

样品：蛋白

观察方式：cryo TEM

样品：病毒

观察方式：cryo TEM

样品：纤维

观察方式：cryo TEM

样品：细菌

观察方式：cryo TEM