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病毒侵染动态研究莫发愁,FLIM-FRET显身手

齐瑶

 

2020年, “病毒“这个词反复出现在公众的视野里。当我们在感慨着病毒凶猛、人类渺小和生命无常的同时,对于病毒以及相关的研究技术,我们又了解多少呢?


研究难点


病毒是一种个体微小、结构简单、只含一种核酸(DNARNA必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。而病毒侵染宿主细胞却是一个非常复杂的过程,主要分为吸附(Attachment、进入(Entry/Penetration)、复制(Replication)、大分子合成(Biosynthesis)、装配(Assembly)、释放(Release)等几个阶段,如图1



如何从初始的吸附和进入阶段进行干预阻断,是病毒性疾病防治的切入点之一。以人类免疫缺陷病毒(HIV,也就是引发艾滋病的病原为例,它通过颗粒表面的包膜糖蛋白(Env)与免疫细胞表面的CD4分子、辅助受体互作,实现病毒与宿主细胞的融合、感染过程。科学家们曾运用BlaM(β-内酰胺酶分析:测量细胞群中病毒融合的技术)或细胞内病毒衣壳蛋白p24分析等多种方法对病毒的侵染过程进行检测,但由于技术的限制,均不能直接实时监测病毒进入宿主细胞的动态融合过程[2]。因此,在时间和空间上都具备高灵敏度的FLIM-FRET,成为了该项研究的破冰技术。

FLIM-FRET

经常关注徕卡课堂的同学们,想必对FLIM-FRET都不陌生了。在这里,我们再简单回顾一下几个关键性的概念。

荧光寿命:荧光是指荧光分子吸收能量后,其处于基态(S0)的电子跃迁至激发态(S1),经过短暂停留,由激发态(S1)再回到基态(S0)时释放出光的现象,而荧光分子停留在激发态的时间就是荧光寿命(图2A)。与荧光光谱一样,荧光寿命也是荧光物质的一种内在特有性质。

FLIMFluorescence Lifetime Imaging荧光寿命成像):是一种基于荧光寿命的显微成像技术,其成像结果提供像素位点的寿命信息(如图2B),使得我们在荧光强度成像之外,能更加深入地对样品进行功能性测量。荧光寿命成像具有不同于荧光强度成像的众多优点,如不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响。但会因为分子构象、分子间相互作用、分子微环境、生理状态等条件改变而发生变化,因此荧光寿命可用于分析分子的这些变化,基于荧光寿命测量的FRETFLIM的重要应用之一。



图2. A. 荧光寿命示意图;B. FLIM:提供每个像素位点的荧光寿命信息(左);基于荧光寿命信息的细胞成像结果(右) 

FRETFluorescence Resonance Energy Transfer,荧光共振能量转移):供体荧光基团(Donor)的发射光谱与受体荧光基团(Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠,当供体被激发后,且两个荧光基团间的距离小于10nm时,处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体,使受体被激发,即发生荧光能量的非放射性转移现象,为FRET(如图3),这一过程也伴随着供体荧光寿命的缩短和受体荧光寿命的延长。


图3. FRET原理(左)[2]及FRET实例(右)

FLIM-FRET兼具 FLIM FRET 两者的优势,不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响,且样品制备简单,测量结果准确性高,易重复。因此,FLIM-FRET非常适合于进行分子间相互作用、分子构象或生理状态改变等的研究。 

应用实例

那么科学家是如何将FLIM-FRET应用于监测HIV病毒侵入宿主细胞的动态过程呢,让我们看以下两个实例: 

        (一) 利用FRET生物传感器示踪HIV进入宿主细胞过程[3]

来自牛津大学的研究者设计了一个HIV-Chameleon生物传感器,由一对能够发生FRET的荧光团(mTFP1eYFP)组成,两个荧光团之间通过短肽序列包含烟草蚀刻病毒TEV蛋白酶切割位点)链接在一起(如图4A右)TEV蛋白酶(TEVp)可以与HIV-1 Vpr蛋白或Gag蛋白融合,掺入病毒颗粒中。当包含TEV蛋白酶的病毒与表达生物传感器的细胞融合Vpr-TEVGag-TEVrTEV被释放到细胞质中