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荧光入门介绍

荧光是George Gabriel Stokes于1852年首次报道的一种现象。他观察到萤石在紫外线照射后开始发光。荧光是光致发光的一种形式,是指一种材料被光照射后会发射出光子。发射光的波长比激发光更长。这种效应又称为斯托克斯位移。

以荧光为工具在显微镜中的应用

荧光在显微镜中有着广泛的应用,是观察特定分子分布的重要工具。细胞中的绝大多数分子并不会发出荧光,因此必须用荧光分子即所谓的荧光素进行标记。对于感兴趣的分子可以直接标记(例如,用DAPI标记DNA),或者使用可与特异性抗体偶联的荧光素进行免疫染色。免疫染色时通常必须对细胞进行固定。

荧光显微镜还可对活细胞或组织进行延时成像。为此,对于感兴趣的蛋白质可以使用基因编码的荧光分子进行标记,如GFP(绿色荧光蛋白)。对于感兴趣的分子(如Ca2+)还可以使用可逆结合的合成染料(如fura-2)或转基因天然蛋白质(如GFP衍生物)进行标记。

图1:当特定波长(激发波长)的光照射到分子上(例如照射到荧光团中)时,光子会被分子的电子吸收。然后,电子从它们的基态(S0)提升到更高的能级,即激发态(S1’)。这个过程被称为激发(1)。激发态寿命很短(通常为10-9/-10-8秒),在此期间电子的一些能量会丢失(2)。当电子离开激发态(S1)返回基态(3)时,它们会失去在激发过程中获得的剩余能量。荧光团的获得的能量会以光子形式释放,释放的光子波长以比激发光波长更长,从而能量更少。这种现象被称为斯托克斯位移。

荧光的机制原理

荧光素只有在用对应波长的光照射下才会发出荧光。波长取决于荧光团的吸收光谱,必须确保输送适当量的能量才能将电子提升至激发态。电子激发后只能在这种高能状态下停留很短的时间。当电子弛豫到基态或其他能级较低的状态时,能量则以光子的形式释放出来。由于该过程中会出现一定的能量损失,因此与吸收的光相比,荧光素所发射出的光波长更长且能量更低。

图2:COS 7细胞,绿色:无特征蛋白质,GFP,红色:α-微管蛋白,Cy3,蓝色:细胞核,DAPI。感谢中国上海SIBS、CAS、生物化学与细胞生物学研究所边玮提供的图片。

图3:小鼠成纤维细胞,绿色:F-肌动蛋白,FITC,红色:微管蛋白,Cy5,蓝色:细胞核,DAPI。感谢德国海德堡Max Planck医学研究所Günter Giese博士提供的图片。

图4:小鼠原代海马神经元细胞,蓝色:转染细胞标记;绿色:肌动蛋白,TRITC;红色:GluA Ampa受体单位,Texas Red;灰色:突触小泡蛋白,Cy 5

图5:果蝇幼虫,绿色:RNA结合蛋白,Alexa 488

磷光的机制原理

由于磷光分子发光的时间比荧光素长得多,因此它们储存激发能量的方式肯定有所不同。这种差异的基础在于两种形式的激发能级,即单重激发态和三重激发态都基于不同的自旋排列。

自旋是电子的一种属性。简单来说,自旋描述了由电子旋转引起的角动量。电子的自旋方向可以是正方向(+1/2),也可以是负方向(−1/2)。更高能级的自旋配对可以在相互方向上平行或反平行。在反平行自旋配对中,单个角动量相互补偿,同时自旋总值为零。这种自旋排列就称为单重态。两种平行自旋互不补偿且所得数值不同于零值,在这种情况下,自旋被称为三重态。

当电子从单重态激发态回到基态时,就会产生荧光。但在某些分子中,被激发电子的自旋可以在一种称为系统间交叉的过程中转换为三重态。这些电子失去能量,直到它们处于三重基态。这种态比基态具有更高的能量,但也比单重态激发态具有更低的能量。因此,电子无法切换回单重态,也不能轻易地返回基态,因为量子力学只允许自旋总值为零。因此分子被困在其能量状态当中。

但从三重基态到基态的一些变化有时还是有可能的。这些变化会发射出光子和磷光。由于一次只有少数事件可能发生,三重基态呈现为能量储库的形式,因此能够在更长的一段时间内发出磷光。

图6:果蝇,幼虫龄期,绿色:Feb211阳性神经元及其轴突,Alexa 488;红色:CNS纤维部分(即所有轴突),Cy3;蓝色:细胞核,DAPI。

感谢德国Eggenstein-Leopoldshafen毒理学与遗传基因研究所,Karlsruhe研究所Christoph Melcher博士提供的图片。

图7:小鼠肾脏切片,绿色:肾小球和肾曲小管,Alexa 488 WGA;红色:F-肌动蛋白(普遍存在于肾小球和刷状缘);蓝色:细胞核,DAPI

图8:新生心肌细胞,黄色:DNA,DAPI;绿色:肌间蛋白,Cy3;红色:钙粘蛋白,Texas Red;蓝色:肌动蛋白,Alexa 633

图9:荧光显微镜下获得的分裂中期FISH染色染色体。感谢东京大学前沿科学研究生院人类进化实验室Yumiko Suto博士提供的图片。

冷发光在显微镜中的应用

对于显微镜,荧光是最为实用的一种冷发光。荧光素可以很容易地通过特定的光源(如灯和滤光系统或激光器)在特定波长下激发,发射光和激发光可以通过波长来加以区分(斯托克斯位移)。

利用荧光成像,实验室人员可以对细胞内的分子数量和位置进行特征描述。荧光显微镜的另一个优点是可以同时使用几种荧光素。荧光素只需其激发和发射波长不同即可。因此,不同目标分子均可同时观察并开展大量的实验,例如开展共定位的研究等。

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