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荧光入门介绍

荧光是George Gabriel Stokes于1852年首次报道的一种现象。他观察到萤石在紫外线照射后开始发光。荧光是光致发光的一种形式,是指一种材料被光照射后会发射出光子。发射光的波长比激发光更长。这种效应又称为斯托克斯位移。

以荧光为工具在显微镜中的应用

荧光在显微镜中有着广泛的应用,是观察特定分子分布的重要工具。细胞中的绝大多数分子并不会发出荧光,因此必须用荧光分子即所谓的荧光素进行标记。对于感兴趣的分子可以直接标记(例如,用DAPI标记DNA),或者使用可与特异性抗体偶联的荧光素进行免疫染色。免疫染色时通常必须对细胞进行固定。

荧光显微镜还可对活细胞或组织进行延时成像。为此,对于感兴趣的蛋白质可以使用基因编码的荧光分子进行标记,如GFP(绿色荧光蛋白)。对于感兴趣的分子(如Ca2+)还可以使用可逆结合的合成染料(如fura-2)或转基因天然蛋白质(如GFP衍生物)进行标记。

图1:当特定波长(激发波长)的光照射到分子上(例如照射到荧光团中)时,光子会被分子的电子吸收。然后,电子从它们的基态(S0)提升到更高的能级,即激发态(S1’)。这个过程被称为激发(1)。激发态寿命很短(通常为10-9/-10-8秒),在此期间电子的一些能量会丢失(2)。当电子离开激发态(S1)返回基态(3)时,它们会失去在激发过程中获得的剩余能量。荧光团的获得的能量会以光子形式释放,释放的光子波长以比激发光波长更长,从而能量更少。这种现象被称为斯托克斯位移。

荧光的机制原理

荧光素只有在用对应波长的光照射下才会发出荧光。波长取决于荧光团的吸收光谱,必须确保输送适当量的能量才能将电子提升至激发态。电子激发后只能在这种高能状态下停留很短的时间。当电子弛豫到基态或其他能级较低的状态时,能量则以光子的形式释放出来。由于该过程中会出现一定的能量损失,因此与吸收的光相比,荧光素所发射出的光波长更长且能量更低。

图2:COS 7细胞,绿色:无特征蛋白质,GFP,红色:α-微管蛋白,Cy3,蓝色:细胞核,DAPI。感谢中国上海SIBS、CAS、生物化学与细胞生物学研究所边玮提供的图片。