徕卡TauSense技术在自发荧光领域的应用

荧光显微成像技术对生命科学的研究起到了巨大的推进作用，但自发荧光信号往往会对成像结果造成非常大的干扰（图1）。常规的解决方法主要是通过改进制样流程和调节成像参数来进行优化，但这些方法只能起到部分的改善作用，并不能彻底去除自发荧光信号。对于这个实验路上的绊脚石难道真的就没有办法了吗？当然不是，接下来就为您介绍自发荧光的克星——荧光寿命。

图1.铃兰茎自发荧光

荧光分子受到特定激光激发后，从基态跃迁到激发态，再以辐射跃迁的形式发出荧光并回到基态，荧光分子停留在激发态的时间就叫做荧光寿命（图2）。如果自发荧光和我们用来标记样本的荧光基团的寿命存在较大的差异，通过调节荧光寿命检测范围，就可以避免这些干扰信号的接收了。

图2.荧光激发示意图

从激发光开始照射样品到检测器探测到光子的这段时间称作“光子到达时间”。样品的“荧光寿命”与“光子到达时间”呈正相关，而一个像素点中包含多个光子，多个光子到达时间的平均值（Average Arrival Time, AAT）就可以反映该像素点的荧光寿命信息。

徕卡全新推出的带有白激光的STELLARIS系列激光共聚焦显微镜（图3）配备了基于AAT检测技术的TauSense模块，它包含三大项功能，对您的实验大有裨益，大家一起来认识一下吧！

图3. STELLARIS

• TauGating

获得高质量的荧光图像是成像实验最基本的需求，但背景噪音、自发荧光、反射光、杂散光等等顽固分子一次次地挑战着我们的耐心，而使用TauGating即可一键式去除这些干扰因素。

TauGating操作非常简单，如图4，点击“+”或“-”即可灵活修改通道数，可设置多达16个通道，每个通道的时间检测范围均可独立调节。一般来说，上述干扰因素的AAT和荧光信号的AAT存在差异，通过调节时间检测范围即可避开对干扰因素的接收，获得真实的荧光信号。

图4. TauGating操作界面

从图5可以看到，和常规共聚焦成像相比，TauGating消除了背景杂散光，图像的对比度和信噪比得到了极大的提升。

图5. TauGating与常规共聚焦成像效果对比

• TauSeparation

在实验设计阶段，荧光基团的选择是一件非常重要且复杂的事情，不仅要考虑到各种繁杂的光谱组合来避免通道之间的串色，还要考虑使用和共聚焦固定激发谱线相匹配的染料。如此一来，留给我们的选择往往就会很少，如果样本中有自发荧光，染料选择就更加受限了。针对这项问题，TauSeparation可以为您提供绝佳的解决方案。

图6. NE-115细胞4色荧光成像

多色染料拆分

图6中，NE-115细胞同时标记了LifeAct-mNeonGreen、Mitotracker Green、 NuC Red 和 SiR-tubulin共4种荧光染料，但由于LifeAct-mNeonGreen和 Mitotracker Green的发射光谱高度重叠，NuC Red和 SiR-tubulin的发射光谱高度重叠，所以在用常规共聚焦（左图）拍摄时只能体现出两种信号的差异。而在TauSeparation模式下（右图），通过检测AAT，我们使用一个检测器就可以同时将这两种发射光谱重叠的染料区分出来（LifeAct-mNeonGreen-红色，Mitotracker Green-绿色，Nuc Red–青色，SiR-tubulin–品红色），所以只需要使用两个检测器，就可以得到这幅没有串色的4色荧光图像了。

图7. 植物组织自发荧光检测

自发荧光拆分

对于自发荧光的拆分，TauSeparation同样得心应手。例如图7左侧的常规荧光强度图像，荧光信号和背景自发荧光没有区别；右侧的图像在TauSeparation模式下，叶绿体中的自发荧光（蓝色）与来自细胞膜的目标荧光信号（绿色）就可以非常清楚地区分开了，是不是很简便呢？

• TauContrast

当您选择在TauContrast模式下成像时，不但可以获取常规的荧光强度图像，还可以通过AAT获取分子的代谢状态、pH值和离子浓度等功能信息，充分挖掘出样本潜在信息。例如图8中Ca2+浓度会影响荧光基团Oregon Green 的荧光寿命，通过TauContrast可以实时获取Oregon Green的AAT，从而反映各框选区域（ROI）的Ca2+浓度随时间的变化水平。

图8.对哺乳动物细胞钙振荡进行检测

图8. 机械刺激后对标记了Oregon Green 488的哺乳动物细胞钙振荡进行检测。在TauContrast模式下通过检测AAT的变化来记录单个细胞对机械刺激的响应情况。以4.5fps的拍摄速率记录了AAT在不同框选区域的变化轨迹（用不同颜色选择的ROI）。图像尺寸：256 × 256 pixels；Rainbow LUT (TauContrast): 0-4 ns.

通过白激光和AOBS，徕卡率先实现了激发光选择自由；

通过棱镜分光和狭缝检测技术，徕卡率先实现了所有检测器的全光谱检测自由；

这一次，通过TauSense技术，不仅彻底排除了自发荧光干扰，染料选择也更加自由。