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徕卡共聚焦课堂第12讲:光谱检测-如何设定特定探针发射光的光谱检测范围

为了拆分多色成像的发射光谱,首先由分束器或色散元件将不同颜色的光引入到不同的方向[1],带通滤片则能够最大限度地减少串色,并抑制所有残留的激发光,最终到达传感器。在过去,常使用的滤片是普通的玻璃带通滤片。如今,一项革命性的设计诞生了,那就是在多波段组件(探测器)中使用光度计滑块。该设计可以极为有效地探测发射光,同时提供完全可调谐性,与此同时带来的好处是使光谱扫描成为了可能。使用白激光作为光源时,可调谐光谱检测器是唯一与可调谐光源光谱自由度匹配的设备。其他的光谱检测设备使用一系列检测元件,其波段是固定的,但它们不可调谐,灵敏度较低。

玻滤光片

在以前,荧光显微镜总是使用玻璃滤光片作为屏障滤光片。极早期的荧光显微镜是透射系统,即它们在透射光下进行操作。后来该技术完全被反射光束路径(落射光)取代,入射光系统可以更好的进行激发和发射分离。由于荧光强度仅为照明的约10-4到10-10倍[2],所以这是一个至关重要的要求。屏障滤光片必须完成两个任务:首先,尽量阻挡杂散光(由于样品或光学组件中的反射,残留激发光到达探测光路)。其次,如果样品含有多种荧光物质(减少串色),屏障滤光片可以进一步缩小收集的光谱带宽以增强通道信号的特异性。

玻璃滤光片可能由有色玻璃材料制成,有多种不同颜色。然而,有色玻璃的性能取决于其使用的化合物,除了混合各种化学品来接近所需的透射性质外,没有其他方法来设计光谱特性。在设计上更灵活的滤光片基于多层涂层(沉积在透明玻璃上)。这种涂层或多或少为设计可见光谱内的任何带通提供了选择。可以用更复杂的涂层作为多通滤片,具有三个或四个透射波段,中间有反射部分,允许多重激发和检测。

尽管多层涂层技术非常先进,但此类设备的局限性在于其不可调性。为了用于多种染料之间的组合,系统必须配备一组此类滤光片,根据实验需求,这些滤片必须通过手动或电动操作插入光路。这使得基于滤片的系统的灵活性变差,实验效率低下。

图1:基于有色玻璃或干涉涂层的经典带通滤片。要更改探测光谱区间,必须更换滤片。这需要许多滤光片和电动交换装置(©–.)。

多波段分光光度计:探测器

还有一种完全不同的方法可以从整个光谱中选择所需波段,即使用与光谱重叠的机械设备。如果一束光穿过色散元件(棱镜或光栅),色散后的光会根据其能量在空间上扩散,光子的能量与颜色相对应。举一个简单的例子,将色散后的光投影到白色表面上,即可观察到生成的光谱。长期以来,人们用相纸来记录和定量。而现在,人们用数码相机芯片来查看和分析光谱分光镜)。

除此以外,也可以通过在白色表面的位置插入机械狭缝,并测量透射能量来从整个光谱中选择一个窄带。狭缝的位置可以在光谱上移动,然后测量能量分布作为位置的函(光谱仪)。

不同颜色的发射光对应的能量也不同。为了检测样本发射光的全部能量,需要打开狭缝并将其居中,检测窗口就会覆盖发射光谱,并屏蔽光谱的其他部分。这种器件是一种带通滤波器,它的优点是中心频率和带宽都可调谐——它包括任何(单)带通滤波器的可能。此类器件与适当的传感器(或)结合使用,就成为了共聚焦显微镜最通用、最灵敏的检测器。

如前所述,频带光谱仪只能用于单通道实验。然而,生物医学研究中的现代荧光实验需要同时检测多个通道。通过串联机械狭缝装置可以巧妙地解决这个问题[3]。在这种多波段探测系统(后称为“探测器”)中,机械狭缝元件类似于高反射镜。第一个通道所需的波段通过狭缝后,光谱的其余部分被引导到后续的探测器(几乎无损失),到达这些探测器之前再次被反射镜滑块进行选择。理论上,可以无限串联这种波段探测器。由于现实原因,目前的设备最多备5个传感器。

该设计的优点是效率高(狭缝透过率100%,反射镜反射率99%),所有波段的独立自由光谱都可以进行调谐。当用白激光(可调谐光源)进行照明时,探测器是唯一一个能合理地整合激发的高度灵活的装置。此外,每个通道都配有专用的传感器,可以进行独立的电子放大和基线设置。

图2:探测器采用玻璃棱镜,具有高透射率和分光性能。通过可移动的反射镜滑块将光谱分成多个波段。这使得光谱可以分成任何可能的子光谱集,然后被检测器通道测

其他方法

继检测器后,其他的一些设计相继问世,旨在配合多波段方法的优势。其中之一阵列检测器,通常是多阳极光电倍增管,将光谱投射到其上[4,5]。虽然这些设备可以更简单地放大检测信号,但它们有明显的缺点:由于必须对不同部分进行机械分离,使用多阳极阵列会使得收集的光子减少。它们受到光电串扰的影响,无法单独调整放大功率。这些波段本质上是固定的,即不可调谐,因此无法适用于当今使用的荧光染料的各种发射特性——未来发射特性会越来越复杂。这些设备不输出分配给单个发射种类的信号,而只是输出光谱的固定部分。因此,它们必须要通过分解算法对记录的数据进行后处理,以获得有意义的通道数据。(使用探测器,将信号分配给不同发射种类,此时分离可以清除残留重叠。)

阵列探测器还强制要求发射光具备线性色散。因此无法在配备了阵列探测器的系统中使用棱镜,所以只能使用光栅,但其性能具有重大缺陷。第一,光栅输出不均一,衍射的最大值位于闪耀波长处。因此,在较长和较短波长下收集的数据低于真实值。第二,光栅对偏振的依赖性很强,对非偏振光(这是生物荧光发射的典型情况)的衍射效率会降低到50-70%左右(针对表现最好的颜色)。因此需要使用其他光学元件弥补该缺陷[6]。光栅的第三个问题是:输入能量不仅在单一光谱中释放,而且还释放进入了0阶和更高阶的散射光中去。这降低了所有光栅的整体衍射效率。同样也引入了其他更多的光学设备来解决这个问题[7]

这些设备都是基于记录光谱的理念而设计的。然而,除非在非常罕见的情况下,荧光成像不需要记录光谱。荧光成像需要重新计算低效获得的光谱以提供有意义的染料信息。探测器不会受到高阶损耗的影响,也不会受到偏振相关的影响。它提供完全可调的检测带,并具有单独的放大功能。它可以进行线性分解处理,这是一个额外的优势—意味着同时也可以在高分辨率下记录光谱[8]。因此将可调白激光与可调检测设备进行组合是非合理的。

图3:单点探测器(探测器)可以调整样品中各种染料发射的动态差异。与多阳极阵列探测器相反,两个探测窗口都是可调的,并且可以单独调整动态范围。




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