徕卡共聚焦课堂第13讲：声光调制在全光谱型激光共聚焦显微镜系统的应用

荧光最显著的特征是照射光（激发光）和检测光（发射光）颜色之间的偏移，称为斯托克斯位移。因此，在荧光成像中，不仅要将激发光和发射光的相应波长过滤出来，还需要将激发光从发射光中分离。过去，通常用平面光学元件，包括灰色或彩色滤光片和反射镜进行滤光和分光。虽然有多种平面光学元件可供使用，但固定的规格和低切换效率使其在使用上具有局限性，并且采用不同角度或梯度的涂层作为激发光和发射光的调谐方法也被证实并不可行。现在可以采用全新的技术即使用声光可调谐滤波器()控制激发光，用声光分光器()对激发光、发射光进行分光，可以对激发光和发射光进行自由调谐和高速切换。

光栅干涉

为了了解声光器件的工作原理，我们需要了解周期性结构中的衍涉现象。该现象被广泛应用于光学元件和光学仪器中的光栅。简单来说：当两个相干波发生干涉时，如果相干波相位相同，则会发生相长干涉，即振幅会相加；如果相位差为(180°)，则干涉会相消，当入射波具有相同的振幅时，发生相干后振幅为零。如果平面波与一个规则图案（网格）相互作用，则每个网格结构都会产生一个球面波。所有球面波都会相互干涉并产生周期图案。该干涉图样由栅元的距离、入射光的波长和被照射的栅元数量决定。栅元的大小决定模式的调制（由包络函数描述）。

图1：左侧：两个球面波在双缝（最简单的网格）处的干涉。最大值的相长干涉（在物理参数控制的方向上引起密集图案）。正交光线的方向称为0阶，与0阶相邻的第一条线称为1阶和-1阶，依此类推。右图：由7个网格引起的干涉图案。左侧为单色光，右侧为白光。注意高阶的离散度。

三维点阵的干涉

电磁波也可以与三维点阵的元素相互作用。一个著名的应用是通过射线衍射结构分析[1]。这一技术已帮助科学家了解蛋白质结构和功能。射线晶体学基于：进入晶体的波将与其结构相互作用。在特定条件下，波将发生偏转。为了实现这一点，从晶格单元辐射出波的路径差必须是波长的倍数。在这种情况下，波相位相同，会引起相长干涉。布拉格条件[2]阐释了这种关系：

解释见图2。在射线晶体学中，射线束照射在样品上。此处晶格的单元为原子。由于入射波长要和原子间距离在同一数量级，因此射线是一种合适的电磁源。通过记录射线从不同角度（如通过旋转样品）穿过样品后的一系列衍射图可以根据得到的信息重建晶格结构，即晶体中原子的组成和空间排列情况。

图2：布拉格反射：对于给定的晶格常数和入射角，波长为的光发生反射（衍射），当路径差是的整数倍，就会发生相长干涉。因此，布拉格条件概括为：=2 。而角度相同但颜色不同的光线只会穿过晶体。

折射率网格-通过声波进行机械激发

为了将这种现象转化为可见光体系，需要更大的晶格常数（层间距）。在光学晶体中引入机械波可以产生这种晶格。机械波导致介质元素利用密度较高和较低的模式，这一点从声波在空气中引起的密度模式中可以清楚看到。因此，这种晶格由折射率的周期性变化构成，因此称为折射率光栅[3]。机械（声）波的周期取决于所施加声音的频率。为了满足可见光的条件，应用的频率应在几百兆赫范围内。

如果光波和声波满足布拉格条件，光与声波（布里渊散射）的相互作用（作为近似值）与上述模型具有可比性。

事实上，偏转发生在两个方向，+1阶和-1阶，具有垂直极化。为了方便起见，我们可以在在这种情况下省略偏振效应。共聚焦显微镜中的光源是激光器及其配件，它们会发射强偏振光。因此，-1阶光不多，此处可以忽略。因此穿过光（0阶）与偏振无关。

图3：光学晶体中的周期密度变化类似于三维晶格。声波的周期决定了了晶格常数。

声光可调滤波器

如果满足布拉格条件，光只会衍射到一阶。由于声波的频率是可调的，因此可以控制哪种颜色的复合光束进入一阶方向。所有其他颜色将原封不动地穿过晶体并在零阶退出。此外，可以叠加一系列不同频率的声波，以便从一阶方向收集一组颜色。这使得单根谱线可以从一组激光中分离开来，或是从白激光光源中调谐选择可相应色带。

声光效应的效率取决于声波的振幅。随着声波能量的增加，相应颜色的衍射光部分将增加，直到全部发生衍射（饱和）。这使得声波可以在发生衍射的一阶处调节出口光束的强度，从而调节激发光对样品的激发强度。并且每种颜色都可以独立进行调节。

对于多色控制来说，（声光可调滤波器）可以通过频率选择所需颜色的光，同时通过振幅控制该颜色光的强度。因此，通过可以控制光源，使其强度独立可调，且多种颜色独立可调谐。

声波由安装在在声光晶体上的压电元件产生。为避免声波散射或产生驻波，将吸波材料安置在于晶体的对侧。

压电元件由功率放大器驱动，功率放大器的幅度和频率可以控制。通常，声波的频率范围在70到160之间。每种颜色都需要单独的频率；为了同时应用一组颜色时，在馈入放大器之前会先生成一组频率并叠加。

图4：通过声光可调滤光器()从激光组()中选择单条激光线或一组激光线，或从白激光中选择单个波段或一组波段。所有颜色都以全强度照射到晶体上。将一组声波调谐到适当的频率后，激光组的一组谱线或来自白色光谱的一组光带偏转为一阶，用于照射样品，激发荧光染料。其他光通过晶体进入0阶，不用于照明。每个单一颜色的一阶偏转和0阶通过的比率可通过相应声波频率的振幅进行调谐。频率引起一组折射率网格，常数为=/，其中是晶体中的声速。

声光分束器

使用声光分光器 () [4]解决了用可调谐装置向光路引入多种颜色进行荧光染料激发的问题。原则上（但不是特别），它是一种以反向模式运行的声光可调滤波器。当调谐晶体反射所需的波长时，还可以准确地从一阶方向反向引入该波长。在这种情况下，光轴是通过晶体的非衍射路径。因此，激发光将沿光轴离开晶体，并可激发荧光染料。另一方面，发射光符合斯托克斯位移，即发射波长与激发光波长不同。因此，发射光不会在一阶退出，而是简单地穿过晶体并穿过光轴。然后可以将发射光送入光谱探测器，例如徕卡显微系统的光谱型探测器。由于在这种情况下使用非衍射路径，需要将晶体设计成不同的波长激发光通过一阶方向后同轴，而发射光将通过衍射进行偏转。因此必须通过适当的措施进行补偿。因此，声光分束器不仅仅是反向模式下的声光可调滤波器，还需要进行更多更复杂的设计。

图5：将来自激光组或白激光的单根谱线（或一组谱线引入扫描显微镜的光路中。调整声波频率将所需颜色偏转到适当的角度，这些颜色从一阶方向送入晶体。而且光将继续与光轴同轴，并激发样品中的荧光染料。符合斯托克斯位移的发射光将原封不动地通过晶体，最终在检测系统中进行记录和分析。

声光信号

在传统的成像系统中，必须选择激光管、谱线选择滤光片和衰减滤光片，以及适合所选激发波段和预期发射波段的分光镜，因此需要大量的平面光学滤光片装置，还需要了解激发波段、对应分光镜参数，并与相应荧光染料相结合。而使用和[5]的声光结合解决方案不需要任何平面光学设备，可以调节大量激发谱线，而且操作员不需要思考实验中哪个分光镜最适合（避免意外使用错误的分光镜！）。和单次操作同步控制，用来选择激发颜色，其余由显微系统自动设置和调整。

声光结合解决方案对于配备激光组的系统来说是一个很大的优势，可以控制大约8条不同的激光谱线。对于配备白激光的系统来说，这也是唯一合理的设计理念。可以从光谱中选择激发光的颜色，会自动确保准确地引入这些颜色，且发射光会有效地进入到检测系统中。这是唯一能在激发光谱中无级调节的系统。因此，如果采用白激光，则只有系统才能合理地完成任务。

图6：和协同使用。从多色或白色光源中选择需要的颜色。选定的光由引入扫描显微镜的光轴并照亮样品。发射光通过并由光谱探测器进行记录。操作员只需简单地从激光系统提供的颜色中选择所需的颜色，即可同时控制和。会自动调整到该颜色，无需操作者进一步干预。