激光显微切割的典型应用介绍

什么是激光显微切割?

激光显微切割是1990年代发展起来的一项较新技术,让人们从非均质原料中获得均质、超纯样品成为了可能。研究人员可以选择性地、常规地分析感兴趣的区域,直至单个细胞,以获得可重复的、特异的结果。如今,这项技术被广泛应用于许多研究领域,如神经学、癌症研究、植物分析等。在这里,用户报告自己通过激光显微切割所取得的研究成果

1.改善肿瘤细胞的药物遗传学研究

比萨大学实验外科病理学外科研究组Dr. Niccola Funel对胰腺导管腺癌(PDAC)进行了研究。他的研究主要专注于通过发现新技术来为患者定制充分的治疗:

“PDAC是一种侵袭性很强的胰腺肿瘤,PDAC患者的总体生存率很低。PDAC组织表现出强烈的促结缔组织增生反应,可以掩盖真实的肿瘤表达。然而,药物的靶点是上皮细胞而不是基质细胞(促纤维增生反应)。

我们已经证明,激光显微切割提高了PDAC的药物遗传学分析,因为它有助于病理学家只获取肿瘤细胞,从而建立其真正的基因表达。我们比较了激光显微切割的组织和非激光显微切割的组织,发现在mRNA和miRNA表达方面存在显著差异。最后,利用激光显微切割技术,我们发现了方法学的逐步升级可提高分子检测的效率。”

图1: 胰腺导管腺癌(PDAC)冷冻切片,苏木精伊红染色,目镜10倍放大(切割前、切割后及收集检查)。

2.LMD助力不对称干细胞分裂的研究

日内瓦大学遗传医学与发展系Prof. Monica Gotta使用LMD开展了LMD研究不对称细胞分裂研究,该机制可在发育和干细胞更新过程中产生细胞多样性:

"细胞极性的建立和有丝分裂纺锤体的定位是细胞不对称分裂的必要前提。虽然在这些过程中有许多参与者已经被确定,但现在最大的挑战是理解这些过程如何相互调节,以及它们如何调节极性和纺锤体定位。

我的实验室以线虫胚胎为模型系统来研究这些过程。这是一个研究不对称细胞分裂的伟大系统,因为单细胞胚胎是极化的,第一次分裂是不对称的。此外,我们可以结合遗传学,活细胞成像,生物化学和基因组学/蛋白质组学。

胚胎的一个限制是卵壳不允许使用抑制剂。为了克服这个问题,我们了使用LMD。该技术方便我们通过产生小孔来渗透坚硬和不可渗透的蛋壳,这些小孔允许溶解在胚胎安装介质中的药物渗透,从而以高空间和时间分辨率抑制感兴趣的通路或蛋白质。

我们还利用LMD对中心体和微管等其他结构进行机械破坏,从而可以测量野生型和突变型背景下的运动和速度。该系统还被用于在发育过程中消融特定细胞,借此研究细胞功能和/或谱系。”

图2a–b: 野生型单细胞胚胎中的有丝分裂纺锤体消融。表达α-微管蛋白的线虫单细胞胚胎与GFP融合。激光消融前后的有丝分裂纺锤体。两个纺锤极在烧蚀后快速分离s (Grill S. et al., Nature [2001])。

3.Morbus Parkinson谜题

Dr. Falk Schlaudraff在博士论文研究期间于乌尔姆大学应用生理学研究所分子神经生理学团队Prof. Dr. Birgit Liss的指导下在在分子水平上对Morbus Parkinson谜题进行了研究


"关于疾病的起源有几种理论。Morbus Parkinson可以比作一个谜。我们已经找到了许多碎片,可以把其中的一些放在一起,但我们不知道整个画面是什么样子。我们希望有选择地观察参与致病过程的中脑多巴胺能神经元,并使用激光显微切割在单细胞水平进行验证性比较。这项技术使得准确地从复杂的组织中切割出单个多巴胺能神经元成为可能,而无需接触或污染并分析单个细胞中的基因表达。

大脑中最普遍的组织类型是支持组织:如果没有激光显微切割,几乎不可能在分子水平上清楚地描述相对罕见的神经细胞;它们将无法与背景噪音区分开来。对单个细胞的分析常常导致与从完整组织检查获得的结果不同。研究表明,帕金森病患者组织中某些microRNAs的表达发生了改变。我们能够确认整个组织的结果。然而,我们也同时检查了显微解剖的细胞。在这里,我们发现所研究的microRNA表达在单个细胞水平上没有改变。该组织伪影在激光显微切割的帮助下得以发现。"

图3: 人类PD和死后对照大号的单个黑质(SN)的神经元激光显微切割和mRNA-表达分析。通过甲酚紫染色的水平中脑冷冻切片的LMD从PD(a)和对照脑(b)分离出神经黑色素阳性[NM(+)]神经元池(发表于:Gründemann et al., Nucleic Acids Research 1–16 (2008); doi:10.1093/nar/gkn084, 版权所有© Oxford University Press)。

4.拟南芥中的分子网络

米兰大学生物学系Prof. Lucia Colombo和Raffaella Battaglia, Ph.D.的研究旨在了解控制植物繁殖的分子机制。实验室以拟南芥为模式种。从这种小模式物种获得的分子信息通常是突出水稻等重要农艺物种分子网络的基础:

"我们想鉴定并从功能上描述那些在拟南芥雌性器官形成和受精过程中起作用的基因。我们的实验室为理解胚珠分化的分子机制做出了巨大贡献。我们参与了这些基因的鉴定和功能鉴定,这些基因主要编码转录因子,为胚珠分化过程的启动提供重要信号。

MADS-box转录因子是一组重要的关键调控因子,作为分子开关激活导致成熟器官形成的分子级联。尽管MADS-box蛋白在器官识别和花期调控等功能中的重要性已被证实,但迄今为止,MADSbox转录因子的直接靶基因在植物中还很少被发现。利用激光显微切割技术,我们最近发现了第一个由MADS-box转录因子调控的与胚珠分化有关的基因。

我们知道哪些基因由于MADS-box因子缺乏活性而被关闭。我们已经鉴定并在功能上描述了VERDANDI(VDD)基因作为胚珠同一性MADS-box因子的直接靶点,同时也在雌配子体分化中起着基础性作用。将单细胞分析与全基因组方法相结合的可能性给发育生物学带来了强大的推动力。"

图4:激光显微切割有助于识别并从对雌性器官形成和拟南芥受孕期间发挥重要作用的基因开展功能性特征分析。

5.关于衰老的线粒体假说

为什么我们会变老?多年来,科学家们一直在寻找这个问题的答案,尤其是在老年人神经退行性疾病(如Morbus Parkinson)增多的背景下。慕尼黑大学格罗哈登分校神经医院的PD Dr. med. Andreas Bender正在研究衰老的线粒体假说,该假说认为氧化损伤和mtDNA突变的恶性循环是神经元功能紊乱的原因:

"我们的目的是在单细胞水平上研究为什么某些细胞类型比其他细胞更容易患上神经退行性疾病如Morbus Parkinson。通过激光扫描共聚焦显微镜从人死后的脑组织中提取这些细胞后,我们对它们进行了分子生物学检查。特别是,我们正在寻找线粒体DNA(mtDNA)的损伤。到目前为止,线粒体还没有通过单细胞分析得到彻底的研究,尽管越来越多的证据表明它们在神经退行性疾病和衰老过程中起着重要作用。

令我们惊讶的是,在60-70岁的对照组患者中也有很多mtDNA突变,尽管明显少于帕金森组。因此,在第二步中,我们检查了从几个月到一百岁的所有年龄段的人的对照样本。我们发现mtDNA的缺失随着年龄的增长而增加。我们出生时没有或极少缺失,在我们生命的某个阶段,突变的临界阈值达到了50%到60%。

激光显微切割起着极其重要的作用,因为对单个细胞的精确解剖可以确保我们真正检查我们感兴趣的细胞。在激光显微切割时代之前,大多数检查是在匀浆上进行的。这些细胞含有不同类型的细胞,因此我们正在研究的分子连接有时会在巨大的背景噪音中消失。如果一种疾病只影响一种特定的细胞类型,比如帕金森病,我们只有在能够分析同质细胞材料时才能获得有意义的结果。"

图5a–b: 黑质多巴胺能神经元的细胞色素c氧化酶(COX)和琥珀酸脱氢酶(SDH)染色(a)。正常神经元为COX阳性(棕色)。mtDNA高度缺失的神经元

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2021年04月22日 10:33
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