制备烟草叶样品用于扫描电镜观察

烟草叶样品的冷冻断裂SEM图像

含水植物样品，例如烟草叶，如果要放入扫描电镜的真空样品仓内稳定观察，首先做好必要的样品制备处理。样品制备方法可分为两类，脱水干燥处理方法和冷冻制备方法，分别对应常温扫描电镜观察和冷冻扫描电镜观察。临界点干燥和冷冻升华干燥是常见的两种生物样品脱水干燥处理方法，而冷冻制备方法通常是将含水样品快速冷冻后再传送到扫描电镜的冷冻台上进行低温观察。这三种处理方法都可以借助相应的徕卡电镜制样仪器完成，本文主要介绍临界点干燥和冷冻制备方法的实验流程和实验结果对比。

烟草叶样品完整的临界点干燥实验流程包括化学固定、梯度脱水、临界点干燥和常温镀膜等几个主要步骤。如下图所示：

化学固定和梯度脱水的步骤繁多，可以手工完成或采用徕卡EM TP自动组织处理机完成；徕卡EM CPD300临界点干燥仪能对样品进行脱水干燥处理；徕卡EM ACE200/600可以对干燥后的样品进行镀膜，以增加表面导电性。实验细节参数是结果成败的关键因素，以下参考徕卡用户英国杜伦大学的M.Goldberg博士和C.Richardson博士提供的应用文档，列出了实验中各步骤的参数。

1、固定和脱水：

①2%多聚甲醛，2.5%戊二醛，0.1M Cacodylate缓冲液，2小时；

②pH 7.3，0.1M Cacodylate钠缓冲液清洗，2x 10分钟；

③1% OsO4水溶液，1至2小时；

④蒸馏水清洗3x 10分钟；

⑤乙醇脱水：50% 10分钟、70% 10分钟、95% 10分钟、100% 3x 10分钟。

2、EM CPD300临界点干燥的参数：

3、EM ACE600磁控溅射镀膜Pt 3nm.

最后采用常温扫描电镜拍摄，图像如下：

临界点干燥法制备的烟草叶样品

临界点干燥法制备的烟草叶样品

烟草叶叶片的冷冻电镜制样实验流程包括样品快速制冷、真空冷冻转移、真空冷冻镀膜、真空冷冻断裂和升华蚀刻（如有必要）、真空冷冻转移和冷冻扫描电镜观察等几个主要步骤。如下图所示：

其中EM VCM是冷冻工作站，用于烟草叶样品的冷冻及装载；之后通过EM VCT500转移到EM ACE600高真空镀膜仪中进行冷冻镀膜，如需观察断裂面，则用EM ACE600的断裂装置断开样品后，升华蚀刻后再镀膜；常温SEM扫描电镜或FIB聚焦离子束加装了EM VCT500适配的冷冻样品台，可以通过EM VCT500转移样品进行冷冻SEM拍摄。

以下实验结果是中科院遗传与发育生物学研究所的田彦宝老师采用上述实验流程制样之后，拍摄烟草叶样品的冷冻扫描电镜图像：

烟草叶样品表面的SEM图像

烟草叶样品表面的SEM图像

烟草叶样品冷冻断裂面的SEM图像

相比于临界点干燥方法，冷冻制备方法无需繁琐的化学固定过程，样品的微观形貌细节也保存得更好，在观察样品内部结构的断裂面方面，更是有无可比拟的优势。但冷冻制备方法所涉及到仪器操作复杂度有所增加，制备的样品无法长期保存，用户需综合考虑实验室的硬件条件和实验观察目标选择合适的实验方案。