免费下载《高压冷冻如何改善海洋微生物分析》
这些甲藻使用特殊拖网(网孔尺寸为5或10μm)在法国滨海自由城(Villefranche-sur-Mer)湾的地表水中，以10分钟的慢速拖曳收集。在船上收集到样品之后，使用一系列分析筛(来自Retsch)收集尺寸低于40μm的甲藻细胞。在实验室中，此粒径组分:1)以手动泵压的方式，使用1.2μm的混合纤维素酯膜(来自Merck)过滤浓缩:2)重悬为最终体积为4ml的液体:3) 以1000g的离心力，离心处理5分钟。去除上清液，将大约1.2μl的沉淀物包埋到预涂十六烷烯(来自Merck)的A型铜镀金载体(徕卡:200μm深，3mm宽)。使用预涂十六烷烯(来自Merck)的铝质B型载体(来自徕卡)，将表面平坦一侧盖在样品上，然后使用Leica EMICE进行高压冷冻。
冷冻固定样品采用以下程序和解决方案进行冷冻替代(EMAFS2，徕卡):在-90*C的2%四氧化锇丙酮溶液中静置60小时，然后以每小时2*C的速度持续升15小时，直至-60℃，在-60*C下静置10小时，然后以每小时2℃的速度持续升15小时，直至30℃，在-30C下静置10小时，然后在1分钟内，以最大升温速度，升至0°℃;在0℃下静置1小时，然后在1分钟内，以最大降温速度，降至-30°C，再以-30℃的纯丙酮溶液清洗5次。
然后使用EPON树脂逐步浸润甲藻细胞。所用树脂(不含加速剂)/丙酮(体积比)系列溶液为:从-30*C开始，使用25%的溶液，持续2小时，达到·10C:从-10°C开始，使用50%的溶液，持续2小时，达到+10*C，升温速度为每小时10C:从+10℃开始，使用75%的溶液，持续2小时,达到+20°C,升温速度为每小时5C。接着样品在不含加速剂的100%树脂溶液中分别浸润12小时和48小时。
然后在含加速剂的100%树脂溶液中分别浸润两次，各3小时，再隔夜浸润一次，最后在60C下进行48小时的聚合。利用超薄切片机(EMUC7，徕卡)以及钻石(Diatome)切成70nm的薄切片。这些薄切片用1%的乙酸铀酰水溶液染色20分钟，柠檬酸铅染色3分钟。在JEOLJEM 2100plus(采用120Kv电压和8000X放大倍率)上使用SerialEM获得平铺合成图像。使用Imod和Fiji处理合成图像。海德堡欧洲分子生物实验室电子显微镜核心设备团队加工处理的高压冷冻样品。
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图1.在EM-ICE高压冷冻时，图A、图B是将浓缩细胞加到载体中进行高压冷冻，图C是悬浮细胞小团。图D是用于冷冻的载体，左边的铜镀金载体直径3mm，深200μm，右边的B载体采用光滑平坦的一侧作为盖子。
