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柯勒照明:简史介绍和设置的5个简单步骤

在任何特定光学显微镜调试当中,柯勒照明都是实现最佳成像的最重要且最基本的技术之一。尽管柯勒照明应该视为显微镜设置的常规组成部分,但是许多显微镜学家认为正确的设置过于复杂耗时,因此仍然没有被广泛应用。充分了解显微镜的两个主要部件(光阑和载物台下聚光透镜)在实际操作中的调整后,正确的设置就只需要几分钟的时间。正确对齐的显微镜可以大大改善图像的均匀对比度和照明,从而获得更高的分辨率和观察到更多的细节。在这篇文章中除了如何用五个简单的步骤来调整组件外,我们还将回顾这项技术的历史。

于1893年发表的柯勒照明技术以该技术的发明家August Koehler(1866-1948)命名。论文发表时大多数显微镜仍只能依靠镜子和煤气灯作为照明光源。再加上研究人员在显微拍照时使用乳胶板,需要较长的曝光时间,这往往会造成不一致的结果。

简史介绍

1893年,一篇在显微镜学和显微镜技术科学期刊(Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie und für mikroskopische Technik)发表的名为《满足显微照相的全新照明系统》(Ein neues Beleuchtungsverfahren für mikrophotographische Zwecke)”的论文当中,作者提出了当时显微镜专家所面临的主要问题。奥尔(Auer)煤气灯和氧化锆灯是这个时代可用的主要照明光源,但这两种灯存在着产生不必要的“眩光”的倾向。

奥尔煤气灯以奥地利科学家兼发明家Baron Carl Auer von Welsbach(1858-1929)的名字来命名。他的汽灯罩被运用到整个欧洲的街灯之上并因此名声大噪。尽管奥尔煤气灯仍能产生碳酸和一定量的热量,但伦敦气体照明和卫生供水杂志还是惊呼奥尔煤气灯“非常适合”于显微镜观察。

另一种光源氧化锆光源则是一种通过加热锆元素发光的出强化学光源。但在这种光源之下,Koehler认为“很难或不可能获得均匀的照明”。Koehler意识到,为了实现照明的均匀一致性,显微镜的每一个组成部分都需要充分考虑在内并正确地相互对齐。通过调整光阑和聚光透镜,他克服了过热和光线一致性的主要问题(甚至可以用观剧望远镜来代替凸透镜!)。

重要原理

即便到了今天,他的一致性照明技术仍然被广泛使用,并形成了许多技术的基础,包括共焦、相位和微分干涉相差(DIC)显微镜。一旦您了解如何为显微镜正确设置柯勒照明后,它将成为您的习惯并改变您的成像工作。这是光学显微镜最重要的原理之一。

为显微镜设置柯勒照明只需不到1分钟的时间。这将确保光源能对标本进行均匀的照明,从而生成更清晰锐利的图像并且在切片内提高染色区域间或组织区域间的对比度。您还能够采集到标本的更多成像数据。

如果在Powerpoint演示、海报展示或期刊投稿当中需要用到图像,那么柯勒照明一定必不可少。人们花了很长时间才总结出了这里的5个简单步骤操作,而只要在图像采集之前稍加练习就能轻松成为您的习惯操作。

除了显微镜物镜外,若要使用柯勒照明,您还需要认识显微镜里的另外两个组件(需要对这两个组件进行调整)。

视场光阑

‘视场光阑’通常位于仪器的底座(正置显微镜),是显微镜主体的一部分(图1)。一些比较古老(或比较简单的)显微镜可能只有光源的‘开/关’切换而没有使用视场光阑来控制光源的光强度。视场光阑负责控制最终到达载物台玻片上的光线的量。通过控制光源传来的光量,您就可以减少眩光的发生,从而在图像中获得更高的对比度。视场光阑通常由环绕透镜滚轮进行控制。

图1:正置显微镜的主要部件。视场光阑控制来自光源的光强度。聚光镜将光源发出的光聚焦在样品上。孔径光阑负责控制照明光锥的角度。

载物台下的聚光镜

正置显微镜载物台下方(或者倒置显微镜载物台上方但位于光源/视场光阑的正前方)是载物台下聚光镜(图1)。尽管这里也有类似于显微镜微调/粗调对焦功能的对焦轮,但该组件主要用于对焦来自光源/视场光阑的光而不是对焦标本。

‘载物台下的聚光镜’负责收集来自光源的大部分光并将其作为锥形成像光聚焦在显微镜载物台的载玻片上。正确调整聚光镜后,照亮标本并进入物镜的光线将得到充分优化。这将使最终图像呈现均匀的强度和对比度。由于显微镜中的物镜各有不同,因此意味着载物台下聚光镜需要在更改放大倍数时予以调整。

载物台下聚光透镜内有2个组件需要调节后才能设置正确的柯勒照明。这2个组件分别为居中螺丝和光阑。除了视场光阑之外,载物台下聚光镜也有光线控制的光阑,可通过聚光镜划片或滚环来进行调节,这与视场光阑较为类似。该光阑可控制标本照明用的光锥角度。在数值孔径(NA),的相关文章中也提到过,整个显微镜系统的NA并不仅仅通过物镜来决定。确实,当载物台下聚光镜光阑打开时就会让整套仪器的NA增加并获得更高的分辨率、对比度和优化照明。居中螺丝确保了用于照明玻片的光线会正对视野中心,从而在整个标本上形成均匀的照明强度。

5步调节柯勒照明

步骤1:

每次开始成像前都要检查透镜、目镜、物镜是否清洁干净。另一篇文章, 当中介绍了显微镜镜片的清洁处理,但应始终使用透镜清洗纸巾和推荐的溶剂。玻片放置于载物台上,打开光源并调节到最低光强。

步骤2:

标本对焦,但切记如果是在设备共享的机构内使用仪器,则显微镜的设置可能完全不一致。

首先将正置显微镜仪器底座上的视场光阑或倒置显微镜聚光镜上的视场光阑关闭。现在透过目镜进行观察时将只能看到玻片上一小圈的光(图2)。

图2:关闭视场光阑。


步骤3:

现在进行聚光镜的对焦。您坐在显微镜前时,聚光镜的调节轮一般都会位于调焦螺旋的前面。缓慢上下移动聚光镜,同时透过目镜进行观察。您将看到光圈边缘对焦和散焦(从红色条纹变为蓝色条纹)。尽可能将光圈边缘调整到最锐利(图3)。

图3:对焦聚光镜

步骤4:

将光圈调整锐利后,把视线从目镜上移开,观察显微镜的聚光镜组件。您将看到居中螺丝。您可以将聚光镜居中,此时光阑已关闭或者几乎完全打开。我通常在对中聚光镜时会让视场光阑几乎完全关闭,使其保持上述步骤2时的位置。握住螺丝,再次透过目镜观察。当慢慢转动螺丝时会看到光圈会在视野里移动。此时应把光圈瞄准到标本视图的中间(图4)。

图4:居中聚光镜

聚光镜对中后,打开视场光阑直至光的圆圈边缘刚好从视野当中消失为止(图5)。

图5:打开视场光阑


步骤5:

(5) 最后调节的是虹膜光阑(或孔径光阑)。在居中螺丝正下方(或倒置显微镜的上方)您将找到另一个光阑,有点类似于主要视场光阑。透过目镜观察时,这个光阑需要完全打开,然后再慢慢闭合直到图像的‘眩光’完全消失为止。通过关闭孔径光阑,您就可以提高标本的对比度,但分辨率也将随之下降。您应当根据您的眼睛和您所观察的标本在二者之间找到平衡。

5个简单步骤,就是这么简单。

最后总结 – 关闭光阑、对焦边缘、居中光圈、打开光阑并减少眩光。

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