使用MARS受激拉曼探针和组织透明化技术实现组织多靶标三维立体成像

在组织中研究多种蛋白质的空间位置关系，尤其是在三维组织中，在相当多的生物医学研究中都有非常重要的意义。但是荧光多重标记技术存在诸多限制，并且目前能实现多重标记的方法都只支持使用薄的组织切片（<100μm）。这篇文章的研究者利用了受激拉曼光谱成像检测光谱比较窄，不易产生信号串扰的优点，在透明化组织成像中引入了特殊的地中海拉曼探针，对厚达1mm的组织进行了一次性多靶标成像。

受激拉曼显微技术检测光谱比较窄、信号不容易产生串扰，但是其信号比传统的荧光信号强度弱，常规方法很难检测到。研究者结合电子预共振光谱（electronic pre resonance spectroscopy）和受激拉曼显微技术（Stimulated Ramen Scattering microscopy）,可以使染料的拉曼吸收截面增加1013倍，弥补了拉曼信号弱、很难检测的缺点。研究者设计了地中海拉曼检测探针（MARS）结合优化的透明化技术（rDISCO: Raman 3D imaging of solvent -cleared organs），达到了在1mm厚的组织上11种靶标的同时成像。 

首先，研究者设计了地中海拉曼探针MARS。MARS探针使用π形连接的三键产生电子放大，可以使染料的拉曼吸收截面增加1013倍，弥补了拉曼信号弱、很难检测的缺点。在生物细胞中MARS受激拉曼检测光谱为1800-57500px-1。因为所有的透明化试剂在2000-60000px-1光谱范围内都不产生信号，所以没有背景。NHS Ester是常用可以和探针结合的活性基团，已知有4种已经连接了NHS Ester 的MARS探针，研究者新研发了另外四种与NHS Ester 连接的MARS探针，它们和已知的四种地中海拉曼探针在核心原子、环状结构数量、与氮原子的结合方式上存在差异。图1显示了它们的化学结构和光谱特性。

图1 地中海拉曼探针

图 2 c tubulin成像 d 免疫荧光和SRS图像的比较 g 薄脑片的12种靶标同时成像。

Fluorescence: DNA (DAPI), vesicular glutamate transporter 1 (VGluT1-Alexa Fluor 488, glutamatergic neurons, direct immunolabeling), tyrosine hydroxylase (TH-Alexa Fluor 594, dopaminergic neurons, direct immunolabeling) and F-actin (Phalloidin-Alexa Fluor 647); epr-SRS: neuronal nuclei (NeuN; neurons, MARS2228), α-tubulin-MARS2176 (direct immunolabeling), calbindin (CB;

Purkinje neurons, MARS2145), β-III-tubulin (TUBB3; neurons, MARS2200), wheat germ agglutinin (WGA; MARS2242), GABA (γ-aminobutyric acid) B receptor 2 (GABBR2; GABAergic neurons, MARS2212), myelin basic protein (MBP; oligodendrocytes, MARS2188) and GFAP (astrocytes and neural stem cells, MARS2159). 

使用这些MARS探针和抗体结合后，可以对组织内不同的蛋白质进行成像。与传统的免疫荧光图像类似（图2c）。这种方法可用于石蜡和冰冻组织切片的成像。将MARS探针连接lectin就可以看到细胞的膜结构，因为探针的检测光谱很窄，只有12 cm-1，这样就可以实现多个不同的拉曼探针同时成像。因此，研究者在小鼠脑切片上标记了12种marker（8种MARS和4种荧光，图2g）,可以识别出脑片中的不同细胞，包括神经元颗粒细胞、星形胶质细胞、单树突细胞等。

图3 各种透明化方法的SRS成像效果，其中uDISCO方法的信号最好

图4  Volumetric immuno-eprSRS imaging with uDISCO clearing.

a, Volume-rendered image of NeuN (granular neurons) labeled with C-cored MARS2228 in 500-μm-thick cerebellum sections cleared by uDISCO. Single-plane images show good epr-SRS contrast along the whole depth. b, One-shot eight-target volume-rendered images of a 500-μm-thick mouse cerebellum section by RADIANT. A typical workflow for tissue sample preparation, staining and clearing is depicted; Ab, antibody. Fluorescence: LEL (Lycopersicon esculentum lectin DyLight 488), TO-PRO-3 (TO-PRO; cell nucleus stain); epr-SRS: NeuN (MARS2228), TUBB3 (MARS2200), MBP (MARS2176), GABBR2 (MARS2145), WGA (MARS2242) and GFAP (MARS2159). c, Representative single-plane images with zoom-in images at z = 250 μm from the 3D data set in b; scale bars, 100 μm.

研究者还测试了不同的组织透明化方法 scale S、FOCM、Ce3D、3DISCO、 uDISCO等方法对于40-100μm厚组织切片的成像效果，发现uDISCO的成像效果最好（图3）。并且一次对8种目标（6种MARS探针和两种荧光）进行了同时成像（图4b）。

研究者还发现了透明化组织SRS成像最重要的影响因素，就是MARS探针在透明液中会产生降解。因此减少其降解，例如降温到4度或者在透明液中加入DPE和VIT E等还原剂就可以提高成像效果。研究者对一系列透明化方法进行了优化和筛选，最终发现BABB-D4+1%PG在4度下成像的效果最佳，并将这种方法命名为rDISCO （Raman 3D imaging of solvent -cleared organs）。在100μm的组织中，rDISCO成像的信噪比是uDISCO的2.6倍。

图5 Volume-rendered images of GFAP (astrocytes, labeled with MARS2145) and MBP (oligodendrocytes, labeled with Alexa Fluor 488) in 1-mm-thick cerebellum sections cleared by rDISCO. Two-color merged single-plane images show good epr-SRS and fluorescence contrast along the whole depth. g, Zoomed-in, volume-rendered images of GFAP (labeled with MARS2145) in 1-mm-thick cerebellum sections cleared by rDISCO. h, Single-plane images of g at 500-μm depth show fine spatial resolution to resolve fibral structures of astrocytes .Left, zoom-in to the regions outlined by the dashed white box.1-mm-thick samples (n = 3 ROIs). 

用这种方法在1mm厚的脑片上实现了11个靶标的3D大样本深度成像，如图6。

图6 RADIANT with rDISCO clearing enables millimeter-scale, highly multiplexed protein imaging. 

Eleven-target volume-endered images of a 1-mm-thick mouse cerebellum section by RADIANT with rDISCO clearing. Fluorescence: concanavalin A (ConA, Alexa Fluor 350), Griffonia simplicifolia lectin (GS-II, Alexa Fluor 488), TUBB3 (Alexa Fluor 594, direct immunolabeling), TO-PRO (cell nucleus stain); epr-SRS: NeuN (MARS2228), LEL(MARS2200), MBP (MARS2176), GABBR2 (MARS2145), WGA (MARS2242), vimentin (Vim, MARS2212) and GFAP (MARS2159).

这项研究结合了电子预共振光谱（electronic pre resonance spectroscopy）和受激拉曼显微技术（Stimulated Ramen Scattering microscopy），利用特殊设计的MARS探针和优化的组织透明化方法实现了在1mm脑片的11种靶标的一次性成像。这项技术在未来的生物医学上会有非常广阔的应用前景。

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