微信扫码或点击右上角...分享

徕卡STED:CD36介导肿瘤微囊泡释放在肿瘤转移中的作用

随着肿瘤研究的不断深入,为了更深入的研究肿瘤细胞,肿瘤微环境和肿瘤转移的微观程,纳米分辨率显微镜越来越多的应用于肿瘤研究领域。下面给大家分享的这边文章,CD36-triggered cell invasion and persistent tissue colonization by tumor icrovesicles during metastasis 就使用了LEICA STED 3X研究了肿瘤微囊泡在肿瘤转移中的作用。  

研究背景

肿瘤的转移是一个多步骤的复杂过程,它的机制尚在研究中,那么究竟原发肿瘤是通过什么途径转移到第二脏器的呢?传统的推断是通过血液循环或是淋巴循环,如果这个推断成立的话,是肿瘤细胞本身还是肿瘤细胞所产生的某些物质通过循环到达第二脏器,并在那里形成了原发肿瘤的转移灶呢?迄今为止,还没有确定的答案。

不过已经有研究证实在肿瘤转移患者的循环系统中存在肿瘤细胞产生的微囊泡,这篇文章就研究了肿瘤细胞产生的微囊泡和肿瘤转移之间的关系。

肿瘤微囊泡属于外泌体的一种,它的直径在100-500nm之间,在肿瘤发生转移的病人血液循环中可以稳定的检测到,但是研究者对肿瘤微囊泡和它发生反应的免疫细胞及其进入和穿过血管到达组织间隙的机制知之甚少。

CD36是一种脂肪受体,本研究证实它在体外实验中是巨噬细胞内吞肿瘤微囊泡的重要媒介分子。使用纳米分辨率显微镜(STED)成像揭示了微囊泡的内吞过程,在活体动物实验中,小鼠肝微循环中的肿瘤微囊泡以CD36依赖途径穿出血管外,并定位与肝血管旁的Ly6c-巨噬细胞中。

在这篇文章中,作者使用了纳米分辨率显微镜(STED)来观察微囊泡,可以清晰分别观察到微囊泡的膜和内容物在内吞过程中所发生的不同变化,并研究了二者和溶酶体之间的相互作用。

研究过程

首先,作者研究了血细胞的微囊泡被巨噬细胞内化的过程。研究了血小板产生的微囊泡和从循环血中提取的循环微囊泡被THP-1巨噬细胞内化的过程,如图1 AB所示。其中DCF(绿色)标记为微囊泡,DiD标记巨噬细胞。使用STED超高分辨率成像可以清晰的将微囊泡的膜和其内容物区分开来,如图1C。抑制微丝形成的劲松剂D可以减少微囊泡的内化,但是氯丙嗪(网格蛋白途径抑制剂)没有作用。

图1D超高分辨率图像显示了巨噬细胞膜和微囊泡膜共染,提示微囊泡是通过内吞途径进入巨噬细胞内。作者还研究了微囊泡内容物进入细胞后的定位,发现微囊泡内容物和Lamp-1阳性的溶酶体共定位。(如图2E)

  

图1.血细胞微囊泡内化的超高分辨率图像


A) DCF-标记的血小板微囊泡(pMV)和循环微囊泡(cMV)与Vybrant DiD (DiD)-标记的人巨噬细胞 (30 min).

B)DCF-标记的循环微囊泡 (arrows) 被 DiD.标记的巨噬细胞内化(Sixty-minute) 

C)单个微囊泡的纳米分辨率图像。膜标记 DiD 内容物标记:DCF。Scale bars, 0.5 mm.

D) 血小板微囊泡的纳米分辨率图像 膜(DiL; pseudo-colored, blue) 囊泡内RNA (RNASelect; green) 结合的巨噬细胞 (lFM4-64FX, red). 60min  E) 血小板微囊泡在巨噬细胞中和 Lamp1阳性的溶酶体共定位. 60min

随后作者研究了清道夫受体CD36对微囊泡内化的影响。结果表明使用CD36的抗体减少微囊泡的内化,降低巨噬细胞对微囊泡的摄取,经过CD36 siRNA处理的巨噬细胞CD36表达降低,使之降低了微囊泡的摄取。

图2. 肝巨噬细胞(orange)在体内化 DiD-标记的循环微囊泡 (red) SEC, green. CD36抗体降低了巨噬细胞对微囊泡的内吞

下一步又进行了活体小鼠在体研究,尾静脉注射DiD标记的循环微囊泡一小时后,对照组的动物微囊泡显著聚集在血管旁的肝巨噬细胞中。这种作用在使用了CD36抗体的小鼠中被明显的抑制了。(图2)

接下来,研究了人胰腺癌细胞系L3.6pl微囊泡体外和巨噬细胞之间的相互作用,使用STED纳米分辨率显微镜观察,可以清晰的区分微囊泡膜和内容物,被巨噬细胞内化后,囊泡膜荧光信号定位于巨噬细胞膜周围而微囊泡内部的RNA聚集定位于细胞浆,但不和Lamp-1阳性的溶酶体共定位(图3)。作者还研究了小鼠胰腺癌细胞系KPC细胞产生的微囊泡,STED观察的结果和人胰腺癌细胞L3.6pl的微囊泡结果类似图3E。

图3 内化的肿瘤微囊泡分成囊泡膜和内容物。

B) CFP-TF+标记的非肿瘤(CHO cells) 与肿瘤微囊泡(L3.6pl, both blue)在与巨噬细胞的 (DiD,red)作用的2 个时间点的不同定位。C) 单个肿瘤微囊泡的STED图像囊泡膜 (DiD)内容物(RNASelect, DCF)

D) 肿瘤微囊泡 (L3.6pl)与巨噬细胞共孵育60min后被巨噬细胞内化的STED 图像囊泡膜(DiD,pseudo-colored, green) 内容物(RNASelect,pseudo-colored, blue) 巨噬细胞膜(FM4-64FX, red). 

E) 肿瘤微囊泡 (KPC)与巨噬细胞共孵育60min后被巨噬细胞内化的STED 图像囊泡膜(DiD,pseudo-colored, green) 内容物(RNASelect,pseudo-colored, blue) 巨噬细胞膜(FM4-64FX, red).

随后,作者还进行了肿瘤微囊泡的在体研究。尾静脉输入L3.6pl微囊泡24小时后,尾静脉输入L3.6pl胰腺癌细胞,CD36抗体隔天输入一次。8天后,在肝微血管旁的组织中检测到L3.6pl的微囊泡。在0-4天可以检测到微囊泡从血管内到血管外。4-14天都可以检测到吞噬了微囊泡的巨噬细胞。巨噬细胞的表型主要为Ly6c- F4/80+。输入CD36抗体几乎完全抑制了微囊泡到达血管外(图4E)。

图4. 在肝微血管旁的巨噬细胞中长期存在肿瘤微囊泡的内容物 

A) 8d肿瘤微囊泡 (L3.6pl, CMTPX) 出现于肝微血管旁。SEC(肝血窦上皮细胞, green..

B)0-4天肝血管内外 微囊泡定量结果

C)8d 肝组织巨噬细胞摄取肿瘤微囊泡。

D) 4-14d 吞噬了微囊泡的巨噬细胞的亚型。Left:Ly6C (green), F4/80 (orange), DiD (red). Right: quantitative determinations.

E) 14d CD36 对于血管内外L3.6pl微囊泡的抑制作用。

将L3.6pl胰腺癌注射入裸鼠的胰腺,7天后从尾静脉输入L3.6pl细胞产生的微囊泡。输入了微囊泡的裸鼠在肝微血管外的组织中,Ki67阳性率高。且肝转移灶的形成大大高于对照组(没有输入微囊泡组)。ki67是一种增殖细胞的相关抗原,其功能与有丝分裂密切相关,该标记阳性率高表明肿瘤生长越快,组织分化能力越差。

结论

肿瘤微囊泡促进了肝血管外肿瘤细胞的生存,增加了肝转移灶的形成,并且使巨噬细胞转变为Ly6c-免疫抑制的巨噬细胞。

徕卡STED系统对于本研究的贡献

肿瘤微囊泡和外泌体在肿瘤转移过程中有非常重要的作用,但是因为它们非常微小100nm-500nm,所以常规的显微镜下观察比较困难。

Leica STED纳米分辨率显微镜具有以下特性,

  • 达到纳米分辨率:它的分辨率可以达到XY 50nm, Z轴分辨率130nm。
  • 可以覆盖可见光全光谱的染料,可进行多达四色以及Z轴三维纳米分辨率成像。
  • 时间序列观测活细胞内纳米分辨率成像。

在这项研究中,在常规制备的情况下,清晰的将微囊泡膜和内容物分开,并且观察到了微囊泡膜及内容物和巨噬细胞膜之间的位置关系(多色三种荧光标记),内吞后囊泡膜和细胞质膜融合而内容物聚集于细胞浆(时间序列活细胞纳米分辨率成像)。通过STED纳米分辨率显微镜,观测到了之前没有观测到结构和现象,揭示了微囊泡在肿瘤转移中的分子机制。

更多阅读:超分辨率荧光显微镜


参考文献:

1 CD36-triggered cell invasion and persistent tissue colonization by tumor microvesicles during metastasis  Susanne Pfeiler et al. FASEB JOURNAL September 13, 2018. doi: 10.1096/fj.201800985R


提交后,我们将每月自动将您关注领域的行业快讯更新链接通过短信、邮件发送给你
徕卡STED:CD36介导肿瘤微囊泡释放在肿瘤转移中的作用 立即观看
RELATED PRODUCTS
相关产品
STELLARIS 5 Cryo是一个共聚焦光学显微镜系统,可以帮助您针对感兴趣的区域进行定位以辅助冷冻电子断层扫描(CryoET)。STELLARIS 5 Cryo为您提供可靠的目标定位精准度, 同时还能提供您可以信赖的卓越性能,并提高实验效率。
徕卡显微系统采用独特的设计方法,使您可以在一个系统中进行共聚焦和光片成像, 实现柔和的单平面照明。 我们的数字光片系统(DLS)采用垂直设计,可以集成到 STELLARIS 5 和 STELLARIS 8 系统中,也可以作为两种系统的升级。 这样,您就可以受益于完整功能的共聚焦和易于使用的光片显微镜, 从而能够进行更多样化的研究。
当您需要研究传统荧光显微成像方法无法成像的结构时,通过STELLARIS 8 CRS相干拉曼散射显微镜,您可以在工作流程中实现无标记化学成像,应对那些具有挑战性的研究问题。 在STELLARIS 8 CRS中,您可以使用不同模块对各种样本进行高速高分辨率成像: 受激拉曼散射(SRS)、相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS) 、二次谐波成像(SHG)、双光子荧光和可见光共聚焦荧光。
我们的STED技术加入了STELLARIS平台,为您提供超越衍射极限的最快成像方法。在保护样品的同时,立即获得最先进的纳米技术结果,并获得惊人的图像质量和分辨率。STED超分辨率可让您同时研究多个动态事件,因此您可以研究细胞环境中的分子关系和机制。
RELATED DATA
相关资料
2024年05月23日 15:06
TauSTED Xtend 代表了 TauSTED成像技术的下一步演进。它将基于寿命的信息与额外的空间信息相结合,显著提高了分辨率。尤其是在较低的STED 损耗激光功率下,这一结合在令人瞩目的纳米尺度上使多色实时成像成为可能。
2024年05月21日 16:38
徕卡显微系统精准空间生物学解决方案提供从样本取材,到H&E明场成像、多色荧光成像、超多色荧光成像到图像分析,再带激光显微切割技术链接下游的精确分析技术(如质谱等),从整体到微观,覆盖基因组、蛋白组和代谢组领域,解析生物的结构、功能和疾病。
2024年04月19日 15:35
在本电子书中,您将了解3D细胞培养模型(如类器官和细胞球)成像的关键注意事项。探索创新型显微镜解决方案,来实时记录类器官和细胞球的动态成像过程。通过深入的案例研究,我们展示了这些解决方案如何帮助科学家在再生医学、药物研发和疾病研究等领域取得新进展。
wechat
欢迎扫码关注徕卡官方微信,更多显微技巧,行业资讯尽在掌握
close