徕卡共聚焦课堂第17讲：TauContrast在复杂样品成像领域的优势

Timo Zimmermann博士与徕卡STELLARIS共聚焦显微镜的故事

在这次采访中，Timo Zimmermann博士谈到了他在运用TauSense工具方面的经验以及这些工具在研究要求苛刻的样品（例如厚样品或超大胚胎）方面的潜力。作为巴塞罗那基因组调控中心(CRG)高级光学显微镜部门的负责人，Timo Zimmermann博士于2020年在那里测试了STELLARIS 5共聚焦系统。

拟南芥的根-下胚轴连接处。使用TauContrast获取的图像。样品来源：Melanie Krebs博士，COS，海德堡大学。

您使用STELLARIS 5的体验如何？

Timo Zimmermann博士：STELLARIS 5 系统带给我良好的使用体验。该系统上手简单，设置实验时能轻松运用我现有的共聚焦成像知识。看到共焦成像现在扩展到包含基于寿命的信息，我非常高兴。STELLARIS能使用不同的TauSense工具访问基于寿命的信息，这一点我非常喜欢，这在以前非常复杂。现在，只需点击按钮，荧光寿命测量就成为共聚焦实验的另一项附加功能，而这种额外对比对我来说很有意思。

此外，STELLARIS的光效率很高，这要归功于其可在模拟和光子计数模式下运行的新型探测器：只需使用极低的激光功率，即可获得出色的信号结果。

Timo Zimmermann博士

给我们详细说说您使用TauSense的体验。

Timo Zimmermann博士：我经常使用TauContrast功能，它可以将每个像素的平均寿命信息添加为单独的图像通道。由于可以在大部分光谱上使用脉冲照明作为标准激发，所以实际上可以通过检测器直接获得这些寿命信息。这非常重要，因为它以极简单的方式提供了每个荧光信号的另一个维度，实际上是荧光团的决定性特征之一。

我主要把TauContrast用于非常复杂的生物样品。在这些应用场景中，光谱信息往往不太具体，寿命信息可以提供更多的信息，因此能更好地区分结构。换句话说，它有助于更好地理解复杂的形态。我认为，对于包含大量自然信息的外观结构复杂的样品，不仅是观察添加的荧光团，TauContrast还能发挥非常重要的作用，因为除了标记的结构之外，还可以看到这些复杂结构。

那么，使用TauContrast是能让您获得更多信息，还是能让您区分所拥有的信息？

Timo Zimmermann博士：它给我提供了更多信息。如果样品中仅有的荧光信号是通过已确立的荧光标记引入的信号，并且这些信号在光谱上分布良好，则不需要。但如果拥有较多信息（例如带背景的样本或复杂的样本），使用寿命信息有助于区分不同的信息片段，所以当样品中不同的结构发光光谱有很多重叠的时候，TauContrast会帮助我们更容易去理解。荧光团的特征表现在它的激发、发射光谱及其寿命。了解了这三个特征就可以了解荧光团的全部。鉴于荧光光谱中可能存在大量重叠，荧光寿命的检测确实会带来很多帮助。

研究人员还可以利用寿命信息来干什么？

Timo Zimmermann博士：使用TauGating能有效去除厚样品的背景。我们可以用该功能将信号分到不同荧光寿命区域并使用这些通道去除背景。对于要求苛刻的样本（例如厚样本或超大胚胎），拥有寿命信息能带来很大潜力，因为它可以让你把精力放在重要的事情上并帮你更好地了解这些复杂的样品。类器官和模式生物这样的样品观察正变得越来越重要，因为它们更像真实的生物。使用TauSense等新技术可以更好地观察这些样品。

“掌握荧光寿命信息有助于你更好地了解复杂样品。

Timo Zimmermann博士

除了获得荧光寿命信息之外，您认为STELLARIS还可以为显微成像中心用户提供哪些其他好处？

Timo Zimmermann博士：它是非常全面的系统，不仅继承了上一代系统的独特功能，例如共振扫描振镜、AOTF（声光可调滤光片）和AOBS（声光分束器），后两者可以完全代替滤色镜片和分光器组件；而且由于采用白激光，还可以提供激发光谱自由。对我来说，这些都为共聚焦实验提供了关键优势，而STELLARIS改进并增强了这些功能。

如果你要运行显微成像中心，你的系统必须具有灵活性，这一点体现在系统设计中。STELLARIS可以做我们需要共聚焦在显微成像中心设施中做的所有工作，尤其因为它在检测方面没有限制，并且还可以自由使用白激光，根据需要进一步调整激发谱线。如果您需要大功率，可以添加固态激光器。而且，如前所述，白激光是脉冲光源，因此基本上可以灵活使用寿命信息，这是一项巨大优势。

所以，它是灵活性极高的系统。它从所有不同角度为共聚焦实验提供自由：共振扫描振镜在需要时提供速度，因为它可以在成像过程中自由切换；还有性能优异的全能Power HyD探测器，可以在模拟和光子计数模式之间切换。拥有这两种模式确实是非常棒的功能，能为你提供多种可能。你可以在模式之间轻松切换，也可以单独设置每个检测器的模式，从而在动态范围方面拥有很多选择。软件界面ImageCompass采用全新的荧光通道设置设计，极大的简化了荧光通道设置流程。因此对我来说，STELLARIS在共聚焦成像方面具有全方位的适用性。