无像差显微镜光学组件的互动优化
光学显微镜旨在放大肉眼不可见的物体。为此需要采用高品质光学器件来获得优秀的分辨率。但是，所有光学组件都会对光路中的光线带来负面的影响，最终导致像差。本文将重点介绍此过程中涉及的光学元件及其物理参数。在此基础上，本文对减少像差的方法原理进行了一次历史概述。结果表明，将显微镜看作一个整体系统有助于协调其各个组件并获得最佳微观结果。
简介
光学显微镜系统的成像受其组件产生的像差的影响。比如，球面像差、彗差和轴向色差以及横向色差和散光均会干扰图像。但所幸已有可以采取的措施来尽量减少这些影响。
从传统方法来看，制造商试图将相差在其产生的光学组件中消除。随着时间的推移，其原理发生了改变，于是光学器件研发人员们开始将显微镜看作一个整体系统。1992年，Leica Microsystems将这一愿景变为现实，并取名为DELTA系统，一个用于透射光和入射光显微镜检查的通用无限远光学系统。所有用户可无限制地模块自由搭配使用所有光学衬比技术[1]。
1998年，DELTA系统延续这一系统原理并将其进一步发展成为HCS——谐波分量系统，沿用至今。这一系统的主要理念是实现整个显微镜系统所有组件的“协调”。在保留基本目标和功能的同时，HCS使DELTA系统更加通用和开放，因此能够满足用户需求并解决具体问题。
为生成最佳图像，HC系统中的光学组件已彼此匹配，且都参与了光学像差校正：
物镜、目镜、镜筒透镜和摄像头适配器。
由于当代显微镜研究中显著的模块化设计高度依赖于所有光学组件之间的协调性，因此该系统自20世纪90年代问世以来，对最近的显微镜仍有影响（图1）。
图1：三代倒置研究显微镜。配备DELTA光学器件的Leica DM IRB（左）实现了所有光学衬比技术的模块化应用。Leica DM IRE2（中）是20世纪90年代首批引入谐波分量系统的产品之一。2014年推出的Leica DMi8（右）仍受益于这种协调所有显微镜组件的方法。
光学和机械装配尺寸的协调性
图2：无限远显微镜的装配尺寸：增加x后的齐焦距离d效果图。假设物镜和镜筒透镜之间的距离I∞相同，即用于安装照明和对比组件（阴影线表示部分）的空间相同；物镜后面的光学组件的直径以及光学组件到出射光瞳的距离增加。假设正常镜筒透镜的参考焦距fNTL相同，中间图像偏移x。
在无限远光学器件的研发过程中，业内在“长”（1987年以前金相显微镜的参考焦距为250mm）和“短”（镜筒长160mm）参考焦距方面积累了丰富的经验，并对其优缺点进行了深入分析。随着1992年DELTA概念的引入，Leica将200mm参考焦距确定为新标准，将其视为整个系统有效设计的最佳长度。这一概念以协调的方式统一了以前系统的优点，同时消除了它们的缺点[1]
1858年，伦敦显微学会采用经典的皇家显微学会（RMS）物镜螺纹作为显微镜检查的标准螺纹。无限远光学器件的发展和用户需求的改变（比如体视荧光显微镜检查对大孔径物镜需求的不断增长）表明RMS螺纹会阻碍进一步的发展。为创建新的自由度，Leica在1992年推出DELTA系统时一并引进了M25×0.75物镜螺纹。
在DELTA系统的发展过程中，相关人员还研究了是否有必要采用新的、更大的齐焦距离及这样做可能带来的优势。
齐焦距离d是纯机械尺寸，即物体平面和物镜安装定位面之间的距离（图2a）。转动物镜转换器改变物镜时，图像焦点或多或少会保留不变（齐焦）。齐焦距离不仅决定了整合透镜元件所需的空间大小，还会影响物镜和整个显微镜系统的结构和人体工学设计。
尽管较长的齐焦距离（如大于等于60mm）存在特定的优势，有利于设计位于显微观查和宏观检查二者阈值范围内的物镜，但要使显微镜整体的技术设计和应用设计达到平衡，则具有相当大的缺点。
一方面，增加物镜及其随后的光学模块的尺寸会招致许多用户的反对，除此之外，齐焦距离更长也会对人体工学产生不利影响。立式显微镜的观察口和倒置显微镜的标本台位置不可避免地会随着齐焦距离的增加而成比例地升高。
物镜的后焦面（出射光瞳）的位置对随后的镜筒透镜的校正以及物镜和镜筒透镜间无限远光路中图像对比模块的光学和几何设计起着重要作用。齐焦距离越长，出射光瞳和随后的光学元件之间的距离越长、直径越大、校正问题越严重、成本越高等。物镜齐焦距离越长，物镜的对中灵敏度通常会越高[2]，这对于高性能物镜来说尤其不利（图2b）。
为获得均一的显微镜范围，在仔细分析和考虑所有关键方面后，Leica决定保持45mm的齐焦距离不变，事实证明，这是DELTA光学器件的最佳方案。由于HCS系统持续使用此类装配尺寸，因此确保了整个“显微镜工作场所”的光学、机械和人体工学要求得到协调解决。
成像协调性
所述的机械和光学装配尺寸确定了成像和光学像差校正所用的光学组件的几何组装框架。
物镜、目镜、镜筒透镜、摄像头适配器等每个相关组件具有不同的物理功能，因此在校正物理层面不可避免的光学像差时，此类组件均有各自的具体要求。对于待校正像差的产生原因和影响，已有详细说明[1]。
针对“整个显微镜系统”的光学设计，以及校正工作在相关组件之间的分配，显微镜检查中已采取了多种方法。
首先，对每个组件进行无像差设计，这种方法看似很吸引人。虽然原则上这是可能的，但存在校正“过载”的风险：成本太高，达到或超越可能的限度。
对于球面像差、彗差和轴向色差，可以从源头进行有效校正，即从产生这些像差的组件中进行校正。但人们很早就发现，通过校正物镜和目镜就可以最大程度地校正横向色差和像散[3]。自从引进无限远光学器件以来，每台显微镜均配备一个镜筒透镜系统，旨在形成中间图像实像。正如我们所述，可利用该系统在中间图像[4]中建立特定的校正状态，从而创建额外的自由度。
随着1992年DELTA光学器件的推出，物镜的横向色差补偿从目镜转移到无限远镜筒透镜。这是迈向HCS系统的又一重要步骤，为设计宽场目镜带来了特别的优势。
图3：DELTA和HCS系统中散光和场曲的补偿。图中显示了物镜、镜筒透镜和目镜的矢状和子午图像曲线。在HCS系统中，补偿效果协调地分布在所有组件中。
在光学成像中，像散是指沿径向或切向延伸的离轴标本细节在不同距离聚焦的典型现象，即聚焦在矢状凸面或子午凸面上。消除散光后，这些细节重合形成一个单一像面（场曲)，一般来说也就是凸面。在没有场曲和像散的理想光学系统中，像面位于高斯（Gaussian）像面上，标本细节在整个视场中清晰聚焦。
校正像散后的剩余场曲主要取决于所用的物镜类型。物镜结构越复杂，场曲越小。像散的程度尤其受到透镜形状的影响。简单的物镜，如消色差物镜，在满足非球面校正（即球面像差和彗差校正）的基本要求时，总有一定的剩余像散量。使用简单的非球面校正目镜可以“自然地”充分补偿这种剩余像散。
对剩余场曲的进一步校正则需要更加复杂的平场物镜，不过在此校正过程中并未使用目镜。但经验表明，将场曲和散光校正工作更均匀地分布到包括镜筒透镜在内的相关组件，这种做法更加有效。这正是HCS系统采取的方法（图3）。
具体来说，这表示随后的组件将承担各自的补偿工作量，从而分担物镜对场曲的校正工作。如此物镜变得“更加轻松”，并在特殊应用中具有更高的自由度。
技术和应用的协调性
不仅仅是显微镜组件之间可以相互协调，它们与相关应用的结合也可协调。特别是可以根据特定任务对物镜进行定制化设置。考虑到荧光应用这个主要因素，物镜除了应具有出色的平场和色度校正之外，还需具有高UVA透射率和低自发荧光性。
对比度、场平
物镜质量的公认标准为斯特雷尔强度比；该比值显示了像差物镜成像衍射盘中心强度与另一个经过理想校正的相同物镜中对应强度之间的关系[5]。该值的大小决定了图像的对比度。在光学设计中，其目标是使图像中心斯特雷尔强度比达到99%，且该目标已实现。为了满足最高要求，制造公差不得导致高性能物镜的该比值低于95%。考虑到人眼的生理特性，该主题的相关文献中允许像场边缘的斯特雷尔强度下降到80%。
点扩散函数（PSF）旨在实现自发光点爱里（Airy）衍射图案中强度分布的三维可视化显示。中心最大值的高度（强度）和宽度取决于孔径。斯特雷尔强度仅用一个数字来表示物镜性能，而PSF会显示残差的程度和性质等相关信息。因此可以轻松区分球面像差、彗差和散光。
图案越高越薄，对比度和分辨率越高。如果存在像差，中心最大值的强度将下降，且衍射环中的强度将上升，导致对比度降低。除此之外，越往图像边缘，旋转对称性越弱，因此成像准确度也越差。
图4以40倍物镜为典型示例，显示了HCS系统促成的性能改进。
图4：三代FOV 25的物镜点扩散函数。由于NPL FLUOTAR 40/1.30采用有限远系统，散光和慧差使得视场边缘的图像几乎无法用肉眼区分（a）。采用DELTA系统的∞物镜PL APO 40×/1.25呈现出的视场性能已得到改善（b）。采用HCS系统后，相同的物镜产生的场曲明显较小且对比度明显较强（c）。
适用于应用的工作距离
在少数情况下，人们会重点将较长的自由工作距离视为大孔径油浸物镜的特殊性能特征。但在实践中，人们认为的优势常常却会变成劣势。
由于油浸用油的折射系数是一个随温度变化的函数，并且随着温度的变化到一定的区间折光率会骤变，因此具有超大孔径的油浸物镜仅在相对窄的温度区间内才能充分发挥其光学性能。从图5可以看出，油层越厚，折光率中特定温度变化对图像损害越大。为了确保应用可靠，自由工作距离必须与实践中常见的温度区间相匹配，即超过0.1mm的自由工作距离不适用。
图5：斯特雷尔强度比是自由工作距离和油浸温度的函数。90%斯特雷尔强度比是于对比度而言至关重要的一个限值，当与标称值的偏差delta T为10°（温度变化）、孔径为1.40且自由工作距离大于0.1mm时，斯特雷尔强度就已经下降到了该限值以下。
适用于应用的CORR物镜
为了实现物镜的潜在光学性能，又或是为了在变化不定的标本光学条件中实现物镜的特殊应用，HCS系统中的部分物镜安装了校正底座。设计物镜时，已经设想了校正工作中可能存在的盖玻片和浸没介质的厚度和折光率。
如果实际条件不同于这些假设，就会出现球面像差，导致对比度下降。可通过计算透镜组间距的变化来弥补这一缺陷。可校正以下内容：
- 盖玻片厚度与标称值的偏差（图6）
- 不同的浸没介质
- 浸没介质的温度偏差
- 在表面以下聚焦时标本的折光率影响
图6：斯特雷尔强度盖玻片厚度的函数。90%斯特雷尔强度比是于对比度而言至关重要的一个限值，如果使用大孔径干式和水浸物镜，当与标称值存在的偏差D=0.01mm时，斯特雷尔强度就已经下降到了该限值以下。ISO 8255-1标准盖玻片[6]可能具有更高的耐受性。这表明在关键情况下需要安装校正底座。
电气生理学物镜
图7：电气生理学物镜的典型机械设计示例。由于物镜底座细长并有尖头且自由工作距离较长，物镜可自由接近标本。前部最高不可活动的高度为20mm。
在电气生理学中，先将细胞置于温控水溶液中，再用显微操作器处理。比如神经细胞中最弱的电流和电压都是在恒温下测量的。这就对物镜的机械性能提出了特殊要求（图7），例如
- 细长底座，具有尽可能大检视角
- 整个前部采用不活动的防刮表面
- 最小表面电导率
- 最小热导率
光学设计还必须满足以下特殊要求：
- 自由工作距离
- 400-1000nm的宽带复消色差（APO）校正
- 考虑到厚标本中的杂散光效应，在近红外光（NIR）范围内的微分干涉对比（DIC）
- 高UV-A透射率（对于荧光）
- 最低自发荧光性
- 在共聚焦显微镜检查中的适用性
HC目镜
我们已经在[1]中讨论了横向色差。目镜与物镜不同，在接近像场边缘的过程中，目镜中的横向色差不会呈现线性增长（“区域行为”）。以前用过的目镜中子午与矢状图像曲线也表现出了类似的非线性行为。相反，物镜的相应场曲是“无区”的。这种矛盾的行为难以协调，也就是说，尽管在大的像场中对此进行了巧妙的协调，但仍然存在一定量的像散。在HCS系统中，目镜承担了物镜的大部分曲率校正工作。为完成这项任务，目镜变得更加复杂，具有更大的自由度可以校正畸变、散光等剩余像差。因此，HC目镜实现了场曲的“无区”校正。
图8：在谐波分量系统中，目镜承担了物镜的部分曲率校正工作。
概述
显微镜检查技术的多年发展证明，将显微镜整体看作一个系统大有裨益。随着1998年HC系统的引进，Leica Microsystems深入发展了这一愿景，直至今日，仍然有效。1992年推出DELTA系统时曾一并引进了适用于齐焦距离、物镜螺纹和参考焦距的光学和机械装配尺寸，这也就是本愿景的技术理念依据。
HC系统协调了相关系统组件之间的光学校正效果。因此在保持光学系统通用性的同时，可以设计满足其他特定应用要求（如荧光和共聚焦显微镜检查或电气生理学）的物镜。
References
[1] Schade, K.-H., Euteneuer, P. a. Müller-Rentz, A.: Delta – The new System of Microscope Optics fromLeica, Scientific and Technical Information, Vol. X, No.4, pp. 114–122, 1992.
[2] Haferkorn, H.: Optik, Verl. Johann Ambrosius Barth, Leipzig, 1994.
[3] Metz, C.: Neue Okulare zur Ebnung der Gesichtsfelder der Apochromate, Z. f. wiss. Mikr. u. f. mikr. Techn. 37, S. 49–52, 1920.
[4] Schade, K.-H. u. Klein, W.: Optical System for Tube Length Infinity – What Are It’s Advantage?; Scientific and Technical Information, Vol. VI, No 5, pp. 185–191, 1975.
[5] Beyer, H.: Handbuch der Mikroskopie, VEB Verlag Technik Berlin, 1973, S. 91.
[6] ISO 8255/1 – 1986: Optics and optical instruments – Microscopes – Cover classes – Part 1: Dimensional tolerances, thickness, and optical properties, First edition – 1986-09-01.
[8] Krüger, R.: Contrasting techniques of the new Leica DM R HCS microscope system, Scientific and Technical Information, Inf. CDR 1, pp. 37–46, August 1988.
[9] Schönenborn, J.: The illumination optics in the new Leica DM R HCS microscope, Scientific and Technical Information, Inf. CDR 1, pp. 25–36, August 1988.
[10] Schade, K.-H.: Light microscopy: Technology and Application, Landsberg/Lech; Verl. Moderne Industrie, 1993.
