基于徕卡THUNDER高对比度成像技术的转基因斑马鱼胚胎筛选应用流程

摘要

本应用报告介绍了如何利用徕卡显微系统的DM6 B显微镜平台及其集成的THUNDER高对比度成像技术，建立一套高效率、高对比度、适用于低表达蛋白检测的斑马鱼胚胎筛选流程。该技术基于徕卡的光学成像系统，可显著降低厚样本的焦外模糊，提升图像对比度。THUNDER与徕卡的Synapse^TM高速触发系统、8通道LED照明和K8 sCMOS相机协同工作，形成一套便于抽取信息、适用于动物模型筛查的标准化成像方法。

1.品牌与技术背景

1.1 徕卡显微系统简介

徕卡显微系统是一家专注于光学显微成像、数字成像解决方案和样本分析技术的专业制造商。其核心技术体系包括集成于成像平台中的THUNDER高对比度成像技术、LIGHTNING反卷积、高端物镜平台以及sCMOS相机。

1.2 THUNDER技术定位

徕卡THUNDER是一种集成于其光学显微镜平台的高对比度成像技术，专为厚组织与3D培养物设计。该技术通过实时处理，能有效去除由厚样本散射引起的焦外模糊，从而显著提升图像的荧光对比度，特别适合斑马鱼胚胎这类厚度较大、散射显著、荧光表达差异大的样本。

2.应用背景：斑马鱼胚胎筛选的挑战

2.1 行业需求

转基因斑马鱼胚胎广泛应用于发育生物学与体积成像实验（如光片显微镜）。筛选是否具有足够蛋白表达，是进入下游三维成像前的关键步骤。

2.2 传统技术的局限性

• 体视显微镜：分辨率和灵敏度不足，低表达样本容易被漏判。

• 传统宽场显微镜：厚样本下焦外模糊严重，导致对比度下降。

因此需要一种高对比度+低光剂量+高速切换+可靠检测低表达信号的成像系统，而这正是徕卡THUNDER的优势所在。

3.徕卡 DM6 B + THUNDER的筛选方法与工作流程

3.1 使用设备

• 徕卡DM6 B宽场显微镜
• 集成THUNDER高对比度成像功能的图像处理模块
• 徕卡K8 sCMOS相机
• 徕卡Synapse^TM高速触发系统
• 徕卡pE800 8通道荧光光源
• 徕卡HC APO/HC FLUOTAR系列高数值孔径物镜

3.2 操作流程

步骤1：样本安装

将斑马鱼胚胎置于35mm培养皿，适配THUNDER Imager Tissue平台。

步骤2：低倍概览

使用徕卡1.25x/0.04干式物镜进行明场概览观察。

步骤3：LAS X Navigator导航

使用徕卡LAS X Navigator软件标注需要进一步筛查的ROI。

步骤4：高倍确认

切换到高分辨率物镜，配合低光照、短曝光与高速触发，确保内源荧光不受光漂白影响。

步骤5：启用THUNDER高对比度成像模式

在徕卡LAS X软件中开启THUNDER成像模式：

• 基于徕卡光学系统获取的图像数据，实时去除焦外模糊
• 增强低表达蛋白的信号可见度
• 在预览阶段即可获得清晰图像，用于快速判断

4.筛选结果与表现

4.1 对比度提升显著

徕卡THUNDER高对比度成像技术能显著降低由厚样本引入的焦外模糊，使荧光结构边界更清晰，背景噪讯得到有效抑制。

4.2 低表达信号也可稳定检测

徕卡K8 sCMOS的高灵敏度与THUNDER成像技术的背景抑制能力相结合，可在低光照条件下获得高信噪比的图像，非常适合低表达蛋白筛查。

4.3 全流程高效衔接

“徕卡DM6 B显微镜平台 → Leica LAS X Navigator软件 → 集成的THUNDER成像功能”形成连续、快速、可视化强的筛查链路。

5. 应用场景案例

以下流程均由徕卡显微系统成像平台实施：

• 使用具备THUNDER成像功能的徕卡THUNDER      Imager Tissue系统进行低倍概览与荧光筛查
• 以徕卡K8 sCMOS相机在555      nm、2% LED强度、150 ms曝光条件下成像，并通过THUNDER模式实时增强mKate信号对比度
• 研究团队成功在低表达条件下识别目标胚胎，减少无效样本进入下游光片体系