多色显微成像：多通道的重要性

在成像过程中避免荧光串扰的误导效应

多通道一词是指使用多种荧光染料来检查一个样本中的不同元素。多通道成像可以同时观察相关组分和过程，从而为您的观察添加更多背景信息，最终提供更有意义的结果。 这种多色实验的一个例子是活细胞/死细胞实验，该试验已使用两种颜色，但可与额外的标志物相结合，产生 更高的信息密度。 它还有助于观察采用其他方法可能会遗漏的相互依赖性。

图像： 成年大鼠脑。神经元（Alexa Fluor488，绿色）、星形胶质细胞（GFAP，红色）、细胞核（DAPI，蓝色）。图像由中国广州医科大学附属第二医院神经科学研究所和神经内科徐恩教授提供。

简介

多色或多通道显微成像在研究中常用于更好地描述疾病特征，以及更好地了解生物过程。例如在免疫肿瘤学中，有必要研究不同免疫细胞相对于关键生物标记物的位置。在神经科学中，了解神经元突触的复杂性通常需要研究多种蛋白质。在研究连通性时，必须清楚识别不同类型的神经元及其位置。

多通道成像需要使用多个荧光团来对感兴趣的不同标记物染色。为实验选择合适的荧光团组合至关重要。每个荧光团都有一个特征发射光谱，即其发射光的波长范围。大多数荧光团的发射光谱很宽，因此当使用两个或多个荧光团时，它们可能会重叠，导致信号串扰。如果在实验中不考虑串扰，数据可能会导致假阴或假阳的结果，或其他形式的模糊数据。因此，区分荧光团对于在多通道成像时获得最佳结果至关重要。本文详细讨论了在设置多色荧光实验以及避免重大缺陷方面需要考虑的一些事项。

选择合适的荧光团组合

选择合适的荧光团来标记样本时需要仔细考虑，如果要避免串扰，应确保荧光团与活细胞相容，并消除生理学方面的副作用。

尽管市场上提供的荧光染料数量显著增加，但信号分离问题仍然存在。因此，对标记策略的选择仍然非常复杂，而且随着添加的荧光团越来越多，实验的设置也变得更加复杂。

为了避免串扰，光谱分离需要考虑以下因素：

• 荧光团激发和发射光谱必须与系统的光源和滤光片组特性相匹配，并且

• 每个荧光团的发射光谱在探测窗口之间的重叠必须尽可能少。

如何捕捉多个荧光信号？

例如，考虑一种常见宽视场（常被含糊地称为“荧光显微成像”）多色实验的情况。通常会使用宽视场荧光显微镜，因为操作简便且图像采集快。宽视场多色实验中的每个标记都使用专用的激发和发射滤光片组进行识别，这可以确保在从每个荧光团获得单个信号时具有高度的特异性。激发和发射滤光片通常放置在显微镜内单独的滤光片轮中。这种设置已经限制了可以为实验选择的荧光团。样本中的荧光团可能与显微镜中已经安装的滤光片不相容。当然，滤光片组滤色块可以更换为其他市售滤色块，但这个过程通常很繁琐。

选择与可用滤光片和光源相容的荧光团并将样本染色后，下一步就是设置系统。首先必须选择滤光片，然后进行平衡，以达到最大程度的信号探测和最小程度的串扰。接下来要对滤光片进行调整来限制波长带通，并使发射光以各个荧光团的峰值波长为中心。这个步骤能够减少探测到来自其他荧光团的无用发射光。

滤光片通过以下方法“净化”单个荧光团的信号：

• 最大限度减少激发无用的荧光团，也就是那些与所使用的特定滤光片不相容的荧光团；以及

• 消除与所需荧光团的峰值发射波长不匹配的信号干扰（光输入）。

所选的探测窗口带宽决定了将探测到多少无用的信号以及会丢弃多少有用的光信号——窄带宽意味着特异性较高，但效率较低；而宽带宽则意味着特异性较低，但效率较高。使用的荧光团数量越多，这个平衡过程就越复杂。理想情况下，每个荧光团组合都需要一组优化的滤光片，以便从每个荧光团捕获最大的发射强度，同时使探测通道之间的串扰最小化。即使使用此方法，一个荧光团的发射光仍然会渗入用于另一个荧光团的探测通道。因此，通过调整滤光片来减少串扰会牺牲有用信号，这可能导致关键数据丢失。所有这些因素都使获得良好荧光图像变得复杂。

另一个考虑因素是这种激发/发射机制的性质，它意味着每个单独的荧光团必须依次成像，即依次使用一个又一个滤光片，这意味着需要更多时间来更换滤光片和采集图像。这个过程必须为每个位置、焦平面和时间点重复进行，这意味着每增加一个荧光团，采集完整的样本图像就需要更多的时间。在活体样本的实验中，从一个荧光团切换到另一个荧光团所需的时间会限制捕获速度，导致错过快速的过程以及降低各种颜色之间的可比性。

在多通道实验过程中避免串扰的其他方法

可以使用其他消除串扰的方法，例如在采集后进行线性光谱拆分。 这种方法的前提条件是光谱成像，即探测分别包含不同发射信息的多张图像[1]。光谱成像可以在宽视场或共聚焦显微镜上以多种方式进行。在宽视场荧光显微镜中，此操作通常需要专用的滤光片，并且仍然需要连续采集，这非常耗时，而且由于重复激发，容易发生光漂白。

线性光谱拆分法可以确定每个荧光团对每个图像像素的相对贡献，方法是以计算方式拆分所测量信号的荧光元素，并将其与参考发射光谱轮廓匹配。使用线性光谱拆分法需要事先了解荧光团发射光谱，并且通常需要制定复杂的手动后期处理计划。此外，对有噪图像使用这种方法可能容易出错。要避免处理后的图像中出现伪影，必须通过背景消减法去除并非来自荧光团的任何信号。此外，由于线性光谱拆分是一种基于像素的方法，因此它容易受到原始图像或参考光谱中所引入误差的影响。因此，噪声的存在使得光谱拆分后数据的任何潜在误差与荧光团的光谱重叠成比例增加。这种效应会影响低光照强度下拍摄的图像，例如在对活体样本成像时。

是否有更好的方法？

成像领域的最新创新包括将相量分析应用于光谱数据[2]。Cutrale 等人[3]开发了一种有效的方法，即使在低噪声机制中也能拆分多个荧光团，而无需了解发射特性和显微镜的透射特性。该方法既快速又可靠，而且基本上能够分离自发荧光等背景信号和真正的单个信号。

基于相量的分析法最初被认为是一种将荧光寿命信息可视化的有效方法，最近 Cutrale 等人调整了这个方法，能够在不使用参考光谱的情况下实时分离光谱信息。结果是，不仅分离了来自光谱图像采集的荧光信号，而且可以去除无用的信号，如自发荧光，从而改善实验的最终结果。此外，光谱成像数据分析的整个工作流程得到简化，因此它不需要像其他方法（如线性光谱拆分）那样进行广泛的校准。

通过光谱相量分析可以快速可靠地拆分荧光显微成像的光谱图像

光谱成像中运用的相量分析是一种已公开发表的方法，可用于简化多通道成像实验并提高其准确性。 

图 1：MDCK细胞 DNA 用Hoechst（蓝色）染色，线粒体用Alexa 488（绿色）染色，微管用Alexa 555（红色）染色，样本由马尔堡大学 Ralf Jacob 教授提供。