活细胞成像简介

了解复杂且快速变化的细胞动力学是深入探索生物进程的重要一步。因此，现代生命科学研究越来越需要关注于在分子水平上实时发生的生理事件。

观察和分析活细胞时面临的挑战

在固定细胞或组织中，获取样品“分子状态”的信息已是一项艰巨的任务。如果需要获取实时信息，，就必须尽可能在实验过程中保证细胞自然地运行生理机制，因此将加大实验的困难程度。此外，由于很多生理过程的持续时间仅有几秒甚至几毫秒（例如细胞内离子水平的变化），必须在相对较短的时间内采集大量信息。

满足这些挑战性需求的一种方法是采用被统称为活细胞成像的光学技术。活细胞成像可研究活细胞中的实时动态生理过程，而非提供细胞当前状态的一幅“快照”。它把快照转变成了电影。活细胞成像可提供单个细胞、细胞内网络（原位）甚至整个生物体（体内）中动态发生分子事件的空间和时间信息。这些特性让活细胞成像成为了研究细胞生物学、癌症、发育生物学和神经科学中动态生理过程的必要技术。

近年来，电子学、光学和生物化学的迅速发展，使得科学家们更轻松的实现活细胞成像。如今的活细胞成像方法使用优化的显微镜、专用光源、高速相机、高灵敏度探测器和特异性的荧光标记物，可同时提供技术成熟且仍具有创新性的全套解决方案，满足在分子水平上对单细胞或整个细胞网络进行实时研究的挑战性需求。

使用线粒体标记物(MitoRed®)和荧光钙染料(Fluo-4)对细胞进行活细胞成像

图1：荧光钙染料Fluo-4标记的睾丸支持细胞的原代培养。钙染料的位置类似于表征细胞内的钙分布。

图2：线粒体标记物MitoRed®染色的睾丸支持细胞的原代培养。

图3：图1和图2的叠加。观察钙斑和线粒体的共定位情况。

图4：睾丸支持细胞的DIC图像

使用共聚焦显微镜Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像软件获取的图像。由德国亚琛工业大学生物II研究所化学感知系Sophie Veitinger博士提供。（地址：德国马尔堡菲利普斯大学细胞生物学和细胞病理学研究所）

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活细胞成像中的常见问题

活细胞成像通常适用于培养的细胞系（例如HEK细胞、HeLa细胞）、原代细胞（例如皮肤细胞、神经细胞）、急性制备的组织切片（例如脑切片）或整个器官或生物体。因为细胞被带出其原本“自然”的培养环境并会受到光毒性的影响，所以在实验过程中的首要任务是保持细胞的健康状态。

细胞外溶液

不同类型的人工细胞外溶液（林格氏液、人工脑脊液(ACSF)）和培养基（例如Leibovitz L-15）用于为细胞提供维持其生理功能所必需离子和其他辅助因子。用于活细胞成像的培养基成分包括从极简单的“含盐”溶液（例如林格氏液）到非常复杂的混合物（例如Leibovitz L-15），种类繁多。

但所有溶液都有一个共同点，即都包含pH缓冲液，因为暴露在环境中之后，会显著改变培养的pH（通常pH 7.2.-7.4）。在很多细胞外溶液中，pH缓冲液通过添加10–20 mM两性离子有机化学品HEPES（2-[4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙磺酸）来实现。但对于很多细胞来说，细胞外溶液不能用HEPES或其他化学缓冲液（例如MOPS、TES），因为培养基中缺乏pH缓冲碳酸氢盐会对细胞造成伤害。要解决该问题，必须将二氧化碳输送到细胞外溶液中（二氧化碳与细胞外溶液接触时，会转化为碳酸氢盐）。这可以通过两种方式实现：一种是不断输送气态二氧化碳（通常以碳化物的形式：95%的氧气和5%的二氧化碳）到细胞外溶液中，并不断对细胞进行换液。这种方法通常用于代谢周转率高于细胞增殖的切片制备。

另一种常见的方法是将细胞保存在可调节培养环境气体浓度和温度（在很多情况下）的培养室中。在此类培养物中持续供应5-7%的二氧化碳气体，并且可以严格控制温度。必须根据使用的样品类型和实验的持续时间，来确定化学缓冲的细胞外溶液是否足以使细胞保持良好状态，或者是否需要输送二氧化碳甚至使用培养小室。在很多情况下，化学缓冲溶液即可满足细胞培养和短时实验的要求。，因为急性切片代谢周转率要高得多，通常需要足够的二氧化碳供应。但对于很多细胞类型和长时间成像实验，必须使用培养小室。

光毒性

使用荧光染料进行活细胞成像的另一个问题是：激光或高强度电弧放电灯的入射光会损害细胞，即所谓的光毒性。光毒性主要在合成荧光染料被激发时发生。荧光染料被激发后，它们将与分子氧发生反应并产生自由基。为避免光毒性，必须选择尽可能低的光强度和尽可能短的激发持续时间，以将入射高能光剂量保持在尽可能低的水平。在实验设计过程中，还必须考虑实验的持续时间。长时间实验中，通常不需要高帧速率。因此，图像采集的周期频率通常可以从例如每秒10多帧降低到每秒1帧甚至更低。这将显著降低样品上的入射光剂量，从而大幅降低光毒性。

对于低强度荧光信号成像，可以考虑更改图像采集条件设置，比如在大多数情况下，通过将相机功能用作像素合并或提高增益，甚至使用特殊的高灵敏度相机（例如EM-CCD相机）进行成像。这样可以在不增加激发持续时间或光强度的情况下实现更好的信噪比和信号质量，而这两者都会导致更高的光毒性。此外，选择具有长激发波长的荧光基团也可降低光毒性，因为与具有短激发波长的荧光基团相比，传递给样品的能量更低。荧光蛋白（例如绿色荧光蛋白(GFP)）的光敏位点位于被多肽包膜覆盖的蛋白质内部，因此通常没有光毒性。

焦面漂移

此外，在长时间的活细胞成像实验中，很可能发生焦面漂移的问题，，。可以使用配备有软件或硬件控制自动对焦的成像仪器来避免这种情况。

图5：接种了豇豆花叶病毒(CPMV)的豇豆初生叶(Vigna unguiculata "California Blackeye")，在病毒RNA 2中的运动蛋白(MP)和衣壳蛋白(CP)之间的插入GFP基因。GFP以游离蛋白的形式大量表达（因此未融合于MP或CP），并且可以定位在受感染的表皮和叶肉细胞的细胞质和细胞核中。由荷兰瓦赫宁根农业大学，生物分子科学部门分子生物学实验室的Joan Wellink博士及植物科学部门病毒学实验室的Jan van Lent博士提供。

用于活细胞成像的方法

可应用于活细胞成像的宽场和共聚焦显微技术的范围也非常广泛。通常，使用复式显微镜和反差对比方法（例如相差和微分干涉相差（DIC）），随时间观察细胞的生长、聚集或运动过程。此外，通常使用体视显微镜或宏观镜对大型标本（例如发育中的斑马鱼胚胎）进行延时成像。在过去数十年中，先进荧光技术变得越来越重要。共聚焦显微镜应用的迅速增加，使生物研究的视角从平面向三维立体转变。