徕卡DM2500正置显微镜 Leica DM2500 & DM2500 LED 荧光显微镜-中国制造

本次网络课堂中，屈教授不仅向我们介绍了他所带领的研究团队一路走来所发展的STED技术（包括自适应光学STED、相图分析STED、数字增强STED、时空调制STED、频率调制STED等）及其应用，还和我们分享了他们团队荧光染料开发的成果及宝贵经验。将STED的成像技术提升和新型荧光染料“双剑合璧”后，屈教授的团队实现了STED空间分辨率提升、长时间活细胞成像、低损耗光功率成像等多项技术突破。屈教授坦言，他在99年刚到深圳大学时就接触到徕卡SP2共聚焦，至今使用过多款徕卡显微成像设备，并对徕卡显微镜的成像质量和硬件品质给予了很高的评价。

来自于德国耶拿大学的Eggeling教授在此次讲座中主要介绍了他们实验室在生物膜分子运动研究中STED-FCS的应用。分子扩散运动一般可用于分子结合力的研究，例如，荧光标记的小分子在和大分子结合后，由于质量变大，运动速率降低；另一个重要的应用在于在纳米尺度上研究细胞膜上的生物活性。

而研究分子扩散运动的经典方法之一就是荧光相关光谱（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS）。FCS通过测定溶液中微区内发光粒子因布朗运动或化学反应而产生的荧光涨落现象，分析荧光涨落的相关函数而获得单个粒子的浓度、化学动力学等参数信息。细胞膜上的脂筏富含胆固醇和鞘磷脂，是一个高度异质化和活跃的微小区域（<200nm），正是由于这一特点，使得其上的分子运动很难被观察到。

为了研究这一问题，Eggeling教授团队构建了两个荧光标记（Atto647N）的脂类分子，甘油磷脂（PE）和鞘磷脂(SM)，利用FCS来观察这两个分子在质膜上的运动方式。PE和SM在膜上聚集、运动方式不同，SM更加密集，以一个整体来运动，运动速率应该较慢；而PE则是以散落的形式，更自由、快速的运动。使用Confocal-FCS来观察这两者的运动差别，由于空间分辨率的不足，无法得出有效FCS数据来支持以上假设。Eggeling教授进而使用了可以提供更高空间分辨率的STED-FCS来进行观察。分析结果表明PE在膜上是自由扩散，而SM会时不时被有胆固醇参与的“陷阱”捕获而停止运动。线扫STED-FCS结果表明，SM被捕获（trapping）的时间大概持续几秒，且这种现象只有在空间分辨率高于80nm时才可观察到。STED-FCS研究分子运动的方法可用于研究在免疫反应中T细胞的激活过程里脂类分子的运动机制和HIV病毒侵染宿主细胞后的Budding过程中的所涉及的脂类分子。

陈老师在讲座中介绍到共聚焦显微镜在呼吸道病毒的研究中应用领域很多，包括病毒与宿主蛋白的相互作用，例如病毒感染细胞会发生线粒体应激，产生线粒体DNA释放，新冠病毒N蛋白与其他蛋白的离体和在体相互关系等。 

陈老师所在课题组制备了EVD68病毒的单克隆抗体A6-1,,为了研究抗体和病毒颗粒的相互作用，利用了FLIM-FRET技术，测定了两个毒株（KM毒株，Fermon毒株）的六个病毒片段和抗体的相互作用。发现VP1-1与A6-1的相互作用FRET效率最高，并且使用其他的研究手段确定了二者的结合位点。 

还研究了流感病毒的单克隆抗体CR9114，这个抗体和高危的流感毒株H1N1及H7N9的亲和力不高。通过改造抗体的轻链和重链，并且测定了和H1N1及H7N9的FRET效率，证实通过改造提高了CR9114和H1N1和H7N9的结合效率。还使用STED超高分辨显微镜观察了纳米颗粒疫苗的超微结构。

最后，陈老师总结道，FLIM-FRET可以用于呼吸道病毒颗粒和其抗体之间结合力的筛选，也可以用于改造后的抗体亲和力鉴定，在呼吸道病毒研究方面有广泛的应用前景。